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精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells，SSCs)是位于睾丸曲细精管基膜上的一类成体干细胞，SSCs通过自我更新能够维持自身群体数量的稳定，又能发育分化形成精子细胞。精原干细胞具有成体干细胞的特性和胚胎干细胞样的潜能，可以作为研究精子发生、减数分裂的分子调控和细胞重编程的一个理想的体外模型。microRNA（简称miRNA）是一类由高等真核生物基因组编码的18-24个核苷酸组成的非编码单链小RNA分子，对细胞的增殖、分化、凋亡、生殖细胞的发生和性别决定等各种生命现象都具有极其重要的影响，研究发现一些特定的miRNAs与生殖细胞形成及分化具有重要关系。随着二代测序技术的发展，人、大鼠、小鼠、牛和猪等哺乳动物生殖器官的miRNA表达谱及其特征正逐渐被深入认识和研究，这些工作为研究奶山羊睾丸组织和精原细胞的miRNA表达谱提供了可靠的参考依据。miR-204的表达具有生殖器官特异性，在人和小鼠的睾丸组织中高水平表达，并能调控细胞增殖分化。Sirt1（Sirtuin1）基因是去乙酰化酶Sirtuin家族的一员，在小鼠精原干细胞中有很高的表达水平；当Sirt1基因敲除后，小鼠睾丸内Oct4阳性精原干细胞数显著下降，精子发生过程受到阻滞，成熟精子数明显减少。研究发现在小鼠胃癌细胞和成纤维细胞中miR-204靶向Sirt1调控细胞的迁移、凋亡和重编程。miR-204-Sirt1轴是否对精原干细胞的自我更新和增殖有调控作用尚需进一步研究。本实验通过Illumina高通量测序技术分析了奶山羊CD49f阴/阳性精原细胞的miRNAs表达谱，分析两类细胞中精原干细胞标记miRNAs和基因的表达特征后确定分选出的CD49f阳性精原细胞是奶山羊的精原干细胞群；并进一步在个体、细胞和分子水平研究了miR-204-Sirt1调控轴对奶山羊精原干细胞自我更新和增殖的影响。1.奶山羊精原细胞的miRNA表达谱利用免疫磁珠分选法和Illumina深度测序分析技术获得了CD49f阴/阳性精原细胞的miRNA差异表达谱，确定了933个在CD49f阳性精原细胞中表达上调2倍的miRNAs和916个在CD49f阴性精原细胞中上调2倍的miRNAs。比较CD49f阴/阳性精原细胞的miRNAs和精原干细胞标记基因的差异表达谱，发现一些在精原干细胞中特异表达的miRNAs和基因在CD49f阳性精原细胞中高水平表达，例如：miR-221、miR-21、miR-23a、miR-29a、miR-29b、miR-24、miR-199a、miR-199b、miR-27a和Gfra1、Plzf；山羊睾丸组织切片染色证实CD49f主要表达在靠近曲细精管基底膜的精原细胞样细胞的胞膜区，结果说明分选的CD49f阳性精原细胞是奶山羊睾丸中的的精原干细胞群。生物信息学分析发现CD49f阳性精原细胞中差异表达miRNAs的40个靶基因参与到细胞的基因转录、细胞周期和DNA损伤等三个细胞生物学过程，10个靶基因注释到KEGG细胞周期通路中。流式细胞仪检测细胞周期后发现，接近80%的CD49f阳性精原细胞处于G1/G0期，结合生物信息学分析结果推测CD49f阳性精原细胞中差异表达的miRNAs参与调控CD49f阳性精原干细胞的细胞周期。2. miR-204和Sirt1在奶山羊睾丸中的表达miR-204在奶山羊组织器官中的表达分布主要集中在生殖系统中，并在6月龄睾丸中的表达水平最高。miR-204靶基因Sirt1的表达在奶山羊精原细胞的时空分布上和miR-204有相似的趋势。Sirt1基因在6月龄奶山羊睾丸中表达量达到峰值后下调，同时精原干细胞的自我更新相关基因Oct4和Plzf的表达量也相应地下调。双荧光素酶实验证实，在奶山羊上miR-204也靶向Sirt1的3’UTR序列。进一步检测miR-204和Sirt1在分选的奶山羊CD49f和CD90阴/阳性精原细胞中的表达量发现，Sirt1在分选的CD49f和CD90阳性精原干细胞中高水平表达，与miR-204的表达量负相关。以上结果提示miR-204可能通过靶向Sirt1参与奶山羊精原干细胞的调控。3. Sirt1促进自我更新相关基因的表达和细胞增殖Sirt1能够调节多种干细胞的自我更新和多能性，在奶山羊精原干细胞株mGSCs-I-SB细胞中超表达Sirt1后，检测发现SSCs自我更新和多能性相关基因Oct4和Plzf均表达上调，细胞增殖相关基因Myc、PCNA和细胞周期蛋白CCNA1也上调表达。细胞周期检测进一步发现，Sirt1超表达后，处于G1/G0期的细胞显著性减少，而处于S期的细胞显著性增多。结果说明在mGSCs-I-SB细胞中超表达Sirt1后，SSCs自我更新和增殖相关基因表达上调，细胞增殖加快。4. miR-204靶向Sirt1调控奶山羊精原干细胞的自我更新和增殖体外培养奶山羊永生化精原干细胞株mGSCs-I-SB，转染miR-204模拟物后发现Sirt1基因的核酸、蛋白水平显著下调，证实在奶山羊精原干细胞株mGSCs-I-SB中miR-204靶向Sirt1。在mGSCs-I-SB细胞转染miR-204模拟物后，定量PCR、细胞免疫荧光染色和Western Blotting检测发现精原干细胞的自我更新相关基因Oct4和Plzf的表达量显著下调，Oct4、Plzf的表达量和Sirt1的变化趋势一致。转染miR-204模拟物后，奶山羊精原干细胞中G1/G0期的细胞数增多，处于S期的细胞数减少，BrdU阳性细胞数减少。以上结果说明在奶山羊精原干细胞中，miR-204通过靶向Sirt1调控细胞的自我更新和增殖。