细胞死亡对多种疾病的发生和发展有着重要影响。细胞死亡机制的研究对于疾病治疗特别是癌症治疗有重要意义。凋亡和坏死是最常见的两种细胞死亡方式。近年来发现了许多新型细胞死亡方式,例如铁死亡是其中的一种。研究新的细胞死亡方式为阐明许多疾病的发生机制和开发新的治疗策略提供了理论基础。铁死亡在2012首次被定义为一种铁依赖的程序性细胞死亡途径,它与传统的细胞凋亡、坏死和自噬在基因、生化、生理条件、形态学等方面均不同。铁死亡的三个关键要素是二价铁离子(Fe²⁺),特异性脂质过氧化物、脂质过氧化物修复功能缺失或受损。直接抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）的活性、降低GPX4的表达、降低细胞内GPX4辅因子谷胱甘肽（glutathione,GSH）的浓度或直接递送足量二价铁均可以诱发铁死亡。随着对铁死亡机制的深入研究,与铁死亡有关的病理过程和治疗策略获得广泛关注。尤其是在肿瘤治疗领域,大量的研究证实了铁死亡的抗肿瘤效果。利用铁死亡机制清除凋亡耐受型耐药肿瘤细胞为癌症治疗提供了新思路。然而,这一策略在实际应用中仍存在诸多问题,例如实体瘤的低氧微环境、细胞内较低的二价铁浓度,这些都限制了铁死亡的抗肿瘤效果。二价铁离子的匮乏限制了由芬顿反应（Fenton reaction）产生的羟基自由基含量,进而影响脂质过氧化反应的第一步。低氧进一步抑制了脂质过氧化反应的第二步,导致不能产生足量的脂质过氧化物。肿瘤靶向性是铁死亡的另一个潜在问题。由于GPX4在几乎所有器官中广泛分布,且在肿瘤部位难以选择性地提高铁离子和脂质过氧化物浓度,因此通过二价铁离子的靶向递送来杀伤肿瘤细胞极具挑战。抗坏血酸（又称维生素C）也可用于癌症治疗。研究发现,高剂量抗坏血酸可以在肿瘤细胞外液产生大量过氧化氢,其扩散进入细胞后可以引起细胞内ATP耗竭、谷胱甘肽含量降低等,最终导致细胞死亡。这种细胞杀伤作用只对癌细胞具有选择性,不会对健康组织和细胞造成损伤。因此,抗坏血酸可以作为前药在肿瘤组织选择性生成过氧化氢,进而抑制肿瘤生长。研究发现,增加细胞内游离铁的含量可以显著增强抗坏血酸诱导的细胞氧化损伤,而一些铁螯合剂如去铁胺、环吡酮胺等可以减弱这种损伤。其原因在于,大量的过氧化氢进入细胞后与细胞内的铁发生芬顿反应产生具有强细胞毒性的羟基自由基,进而破坏细胞内各组分来杀死癌细胞,实现肿瘤的自由基治疗。刺激响应性纳米载体用于癌症治疗是目前药物科学和抗肿瘤领域的研究热点。相比传统的小分子化疗,刺激响应性纳米载体通过物理包载或化学键合的方式包载抗肿瘤药物,可改善传统小分子药物的药代动力学特性,并利用肿瘤组织的高渗透滞留效应（enhanced permeability and retention,EPR）被动靶向肿瘤部位,利用肿瘤微环境内源性的刺激如低氧、低p H、特异性酶等,以及外部刺激如超声、光照、热、磁场等,可以实现药物在病灶部位可控释放。因此刺激响应性纳米载体具有增加疏水抗癌药物的水溶性、提高药物稳定性、延长体循环时间、特异靶向性、降低毒副作用等诸多优势,可以提高肿瘤的治疗效果。基于纳米递送系统的优点,如果将铁死亡机制与纳米递送策略结合起来,利用刺激响应性纳米载体包载铁死亡诱导剂,一方面可以解决铁死亡治疗靶向性差的问题,另一方面,可以利用纳米载体向细胞内直接递送铁或间接递送刺激内源性铁释放的分子,增加细胞内游离铁的含量,有望显著增强铁死亡效应,增强抗肿瘤效果。在各类刺激响应型纳米载药系统中,脂质-磷酸钙纳米载体（lipid-coated calcium phosphate,LCP）是一种p H响应型纳米载药系统,因其良好的生物相容性和酸敏感特性受到广泛关注。该纳米载体由磷酸钙为内核、脂质双分子层为外层,是一种无机-有机复合纳米粒。内层磷酸钙是一种天然的生物材料,具有良好的生物安全性和可降解性。此外,磷酸钙还是一种酸敏感的材料,当纳米载体通过内吞作用进入细胞后,会在内涵体和溶酶体的酸性条件下崩解,从而释放负载药物。磷酸钙的降解还会导致溶酶体内渗透压的变化,导致溶酶体溶胀破裂,进一步有利于药物扩散到细胞质。外层磷脂包括1,2-油酰磷脂酸（1,2-dioleoyl phosphatidic acid,DOPA）、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（distearoyl-phosphatid,DSPE-PEG）、阳离子磷脂1,-二油烯氧基3-三甲氨基丙烷（1,2-dioleoy1-3-trimethy-lammonium-propane（chloride salt）,DOTAP）等。DOPA是一种两亲性磷脂,其带有磷酸根的亲水端可以通过静电作用吸附在磷酸钙内核表层,进而稳定杂化纳米粒。其它外层磷脂以DOPA修饰的磷酸钙内核为模板,通过疏水相互作用沉积于载体最外层最终形成了脂质双分子层包裹的磷酸钙纳米粒。同时,DSPE-PEG的修饰可以延长纳米粒的体循环时间,改善纳米粒的药物动力学和体内分布。脂质-磷酸钙纳米载体表面还可以修饰大量聚乙二醇,进一步提高纳米粒的稳定性。同时该载体具备亲水内核和疏水磷脂外层,可以实现水溶性药物和疏水药物的共包载。基于脂质-磷酸钙纳米载体结构,本课题假设其可以实现铁离子和铁死亡诱导剂的共包载,将含铁的亲水分子柠檬酸铁铵物理包裹在磷酸钙内核,疏水的铁死亡诱导分子（Ras-selective lethal 3,RSL3）包裹在疏水的脂质双分子层中,利用其p H敏感的刺激响应释放特性,实现药物在肿瘤细胞内的可控释放。同时协同递送高浓度的抗坏血酸,在肿瘤部位富集大量过氧化氢。柠檬酸铁铵中的铁以Fe³⁺的形式存在,在溶酶体释放后可以被铁还原酶（如six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3,STEAP3）还原为Fe²⁺,其通过与过氧化氢发生芬顿反应,一方面可以引发癌细胞凋亡,另一方面可促进脂质过氧化反应增强铁死亡疗效。除此之外,过氧化氢也可以在Fe³⁺的催化作用下分解产生氧气,一定程度上改善细胞内的缺氧状态,有利于增强铁死亡的毒性作用。因此本课题旨在设计一种递送铁和RSL3的脂质-磷酸钙纳米载体,该载体在血液中性条件下能维持稳定结构,延长血液循环时间,在肿瘤部位酸性环境下崩解释放RSL3和铁离子,同时联合递送高剂量抗坏血酸在肿瘤部位产生过氧化氢,通过铁和过氧化氢发生的芬顿反应来强化铁死亡的毒性作用。基于上述假设,本课题设计了一种柠檬酸铁铵和RSL3共包载的脂质-磷酸钙复合纳米粒。利用反向微乳法制备了包载柠檬酸铁铵的磷酸钙无机内核,通过静电相互作用吸附两亲性磷脂DOPA,用于稳定内核结构。将RSL3通过疏水作用包载在外层磷脂中间层,将卵磷脂（L-α-Phosphatidylcholine,PC）、DSPE-PEG2000、胆固醇修饰在纳米粒外层,有利于延长体循环时间,改善纳米粒子的生物相容性。用此方法制备的共包载纳米粒（Ca P-Fe/RSL3）的载药量分别为6.0±0.5%（Fe）和1.1±0.1%（RSL3）。所制备的纳米粒子粒径均在200 nm以内,表明其具备良好的肿瘤被动靶向效应,表面电位呈负电,有利于纳米粒的系统循环。研究不同p H条件下该纳米载体的粒径变化发现,在p H 7.4条件下,纳米载体在24小时之内结构保持稳定;而在p H 5.0条件下,该纳米载体结构发生崩解。药物释放实验同样符合这一规律,在p H 7.4和p H 5.0条件下的药物累积释放率分别为28.1%和42.7%。这是由于磷酸根具有三级解离常数（p Ka₁=2.1,p Ka₂=7.2,p Ka₃=12.7）,在中性环境（p H 7.4）下（p H>p Ka₂）,主要以HPO₄^2-的形式存在,能与Ca²⁺形成稳定的磷酸钙内核;在酸性条件（p H 5.0）下（p H

2）,主要以H₂PO₄^-的形式存在,降低了其与Ca²⁺的静电相互作用,导致磷酸钙纳米载体的逐渐崩解,释放药物。本课题还对该纳米载体与抗坏血酸联合治疗的作用效果进行探究。由于铁死亡和抗坏血酸诱导的细胞凋亡都与细胞氧化损伤相关,于是我们探究了用不同制剂处理的小鼠乳腺癌细胞（4T1）内的活性氧的含量,分别使用三种特异性荧光探针来检测细胞内总活性氧、脂质过氧化物和羟基自由基的变化。结果表明无论是RSL3诱导的铁死亡还是抗坏血酸诱导的凋亡,细胞内都会产生大量活性氧。而RSL3处理的细胞检测到铁死亡特异性“致死信号”—脂质过氧化物的生成,与抗坏血酸的共递送会增强这一信号,验证了芬顿反应对铁死亡的增强作用。羟基自由基作为铁与过氧化氢发生芬顿反应的产物,在抗坏血酸处理的细胞中也能检测到,证明了过氧化氢在肿瘤细胞内的富集。本课题还发现大剂量抗坏血酸会导致细胞内谷胱甘肽含量降低,然而RSL3则没有这种效果。GPX4活性的实验证明RSL3在直接抑制脂质过氧化物酶GPX4的同时不会引起谷胱甘肽浓度变化。为了探究该纳米载体与抗坏血酸联合治疗肿瘤效果,我们分别从细胞水平和动物水平研究了该治疗策略的抗肿瘤疗效。前期实验已经证明RSL3在缺氧条件下的细胞毒性要低于常氧条件,可能是由于低氧含量严重影响了细胞内脂质的过氧化。因此我们设计了一种纳米载体共包载柠檬酸铁铵和RSL3,并联合抗坏血酸递送的策略,来改善缺氧条件下铁死亡效力低的问题。在缺氧细胞毒实验中,联合治疗组（Ca P-Fe/RSL3+Asc）的IC₅₀为1.2±0.2μM,与游离RSL3（4.7±0.5μM）相比,大大增强了细胞毒性效果,几乎等同于游离RSL3在常氧条件下的毒性（1.1±0.1μM）,证实了这一共递送的协同治疗效果。在动物水平上,本课题构建了荷瘤小鼠模型,利用纳米粒包载荧光染料Cy5,通过荧光纳米粒在小鼠体内的荧光分布情况反映纳米粒的体内分布,结果表明该纳米粒可以在肿瘤部位靶向累积。进一步的肿瘤治疗实验证明,此联合递送策略能够有效的抑制肿瘤生长,组织切片染色结果表明该治疗方案仅对肿瘤组织有较强毒性作用,而对心、肝、脾、肺、肾等健康组织没有明显副作用。本课题利用有机-无机杂化的脂质-磷酸钙纳米粒共包载铁和铁死亡诱导剂RSL3,与高剂量的抗坏血酸共递送,通过芬顿反应增强实体瘤缺氧条件下铁死亡的抗肿瘤作用。这一策略的关键在于,高剂量的抗坏血酸可以造成过氧化氢在肿瘤部位的富集。随后,过氧化氢与二价铁在细胞内反应生成羟基自由基,三价铁诱发过氧化氢的分解生成氧气,从而增加铁死亡脂质过氧化物的含量,实现了在肿瘤部位选择性增强铁死亡毒性,避免了对正常组织的副作用。在此研究中,我们开辟了抗坏血酸与铁死亡诱发协同作用的策略,为铁死亡机制在缺氧实体瘤领域的应用提供了实验基础。