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小分子荧光探针因其结构可调控、响应灵敏、选择性高及可视化等优点,在环境分析、生物标记、细胞与组织成像、临床诊断与治疗等领域显示出巨大的应用潜力。应用小分子荧光探针对化学/生物分子的特异性响应,对环境质量的监测和相关生理病理过程的深入研究具有十分重要的意义。由于环境样品和生物体系的复杂性和不稳定性,尤其是生物体系存在自吸收和自发荧光对检测的干扰,开发灵敏度更高、选择性更好和响应更快速的小分子荧光探针用于环境监测与生物分析,仍是当前最具挑战性的前沿课题之一。比率荧光探针可通过自身两个荧光信号峰进行校正,以消除环境因素带来的误差,从而提高检测的准确性和灵敏度,并且由于较为明显的颜色变化,可实现比色检测,因而具有一定的发展前景。此外,近红外荧光探针可有效避免生物体自吸收和自发荧光对检测的干扰,减少对生命组织的损伤和提高成像穿透深度,因而在生物荧光成像分析中显现出了极大的优势和应用前景。本文为了实现环境和生物样品中具有生物毒性的小分子和生物标志酶的高灵敏度检测,以与人类生命健康息息相关的小分子和生物酶为检测对象,利用激发态分子内质子转移（ESIPT）和分子内电荷转移（ICT）机制,构建系列比率型和近红外型小分子荧光探针用于检测光气、肼（N2H4）、碱性磷酸酶（ALP）和β-半乳糖苷酶（β-gal）,并成功应用于环境样品检测和生物检测与成像分析。主要研究内容如下:（1）设计合成一种比率荧光探针2-（1H-菲[9,10-d]咪唑2-基）苯酚（Pi）用于光气的检测。Pi分子具有ESIPT特性,以羟基和咪唑基作为光气的双识别位点,与光气发生亲核取代-环化反应后其ESIPT过程受阻,荧光发生蓝移,在365 nm手持紫外灯的照射下,荧光颜色从绿色变为蓝色,从而实现对光气的比率荧光检测。该探针对光气的检测具有响应迅速（响应时间为30 s）、选择性好和灵敏度高等优点,其线性范围为0-4μM,检测下限为0.13μM。此外,基于Pi对光气的荧光颜色变化信号,将其制作成荧光测试条（FTS-Pi）,在365nm紫外光照射下,有光气存在时,FTS-Pi的荧光颜色由绿色变为蓝色,该变化灵敏且肉眼清晰可见,可实现光气的现场快速检测。（2）设计合成一种比色和比率荧光双信号探针（E）-3-（4-（二甲氨基）苯基）-1-（2-羟基苯基）丙-2-烯-1-酮（DH）用于N2H4的检测。DH分子具有ESIPT特性,以α,β-不饱和羰基为识别位点,能与N2H4发生环加成反应,导致探针的紫外吸收光谱和荧光发射光谱发生蓝移,溶液颜色从黄色逐渐变为无色,从而实现N2H4的比色和比率荧光双信号检测。该探针对N2H4的检测具有选择性好和灵敏度高等优点,其检测下限为0.06μM,线性范围为8-100μM。此外,DH可成功应用于实际水样中N2H4的检测。（3）设计合成一种比色和比率近红外荧光探针2-（（6-羟基-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基）亚甲基）丙二氰（HM）用于N2H4的检测与成像分析。选取近红外荧光染料为荧光母核,以亚甲基丙二氰作为N2H4的识别基团,具有强拉电子能力的亚甲基丙二氰与N2H4反应后生成腙衍生物,拉电子能力明显减弱,探针分子原有的推拉电子结构改变,分子内电荷转移ICT过程受阻,导致探针的紫外吸收光谱和荧光发射光谱发生蓝移,溶液颜色从深蓝色逐渐变为淡黄色,从而实现N2H4的比色和比率荧光双信号检测。该探针对N2H4的检测有选择性好和灵敏度高等优点,线性范围为1-900μM,检测下限为0.09μM。此外,由于其优异的光学性质及良好的生物相容性,HM可成功应用于人正常肝细胞（LO2）中N2H4的成像研究。（4）以2-（2’-羟基苯基）苯并噻唑（HBT）为荧光母核,基于碱性磷酸酶（ALP）的特异性酶解反应,以磷酸基作为ALP的识别位点,设计合成一种比率荧光探针2-（苯并[d]噻唑-2-基）磷酸二氢苯酯（PBT）用于活细胞内ALP活性的检测。在ALP的催化下,PBT发生酶解反应生成HBT,因HBT具有典型ESIPT特性而荧光恢复,从而实现对ALP活性的荧光检测。该探针对ALP具有较高的选择性和灵敏度,线性范围为1-80 U/L,其检测下限为0.8 U/L。此外,PBT可成功地应用于LO2和人肝癌细胞（HepG2）细胞中ALP的荧光成像分析。（5）以近红外荧光染料（E）-2-（3-（4-羟基苯乙烯基）5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚甲基）丙二腈（DCM-OH）为荧光母核,基于β-gal的特异性酶催化反应,以β-半乳糖苷基为识别基团,设计合成一种近红外荧光探针2-（5,5-二甲基-3-（（E）-4-（（（2R,3S,4R,5S,6S）-3,4,5-三羟基-6-（羟甲基）四氢-2H-吡喃-2-基）氧基）苯乙烯基）环己-2-烯-1-亚甲基）丙二氰（DCM-β-gal）用于活细胞内β-半乳糖苷酶（β-gal）活性的检测。在β-gal的催化下,DCM-β-gal发生酶解反应释放荧光母核DCM-OH,使得荧光恢复,从而实现对DCM-β-gal活性的荧光检测。该探针对β-gal的检测具有选择性好和灵敏度高的优点,并存在0.08-1 U/mL和1-4 U/mL两段检测线性范围,检测下限为1.6×10-3U/mL。此外,DCM-β-gal可成功应用于卵巢癌细胞（SKOV-3）内β-gal的成像分析。