研究背景：肝细胞癌(HCC),简称肝癌,是目前发病率、死亡率较高的恶性肿瘤之一。在我国,肝癌是最常见及预后最差的恶性肿瘤,死亡率约为20.4/10万,占我国全部恶性肿瘤死亡人数的18.8%,居第二位。所以对肝癌发生发展机制、预后诊断等内容的研究,一直是肿瘤学研究的热点。经过多年来对肝癌的临床研究,尽管已在肝癌的发病机理、分子诊断、预后评估等方面取得较大进展,但肝癌五年生存率仍相对较低。故从研究肝癌相关基因着手,完善对肝癌发病机制的系统认识,对阐明肝癌的发病机理以及开发出新的诊断、治疗手段,具有重要的现实意义。小分子RNA (miRNA)是由21-25个非编码核苷酸组成的微小RNA分子,通过与靶基因mRNA的3’非翻译区(3’UTR)部分或完全匹配来抑制靶基因的翻译或降解靶基因的mRNA。通过调控癌基因或抑癌基因的表达,microRNA可以介导肿瘤的发生与发展。研究人员在肿瘤之中发现越来越多基因与表观遗传均伴有microRNA的改变,功能学实验阐明了这些microRNAs在肿瘤的生长和发展中起着促进或抑制的作用。microRNAs介导调控肿瘤的发生与发展的途径可能有以下几种：与抑癌基因结合的microRNAs过表达或信号放大,与癌基因结合的microRNAs内源性丢失。已发现多种miRNA与癌症有着密切的关系,最近研究人员发现miR-590-5p (miR-590)在肝癌中高表达,并通过下调TGF-βRII抑制TGF-β/SMAD信号通路进而调控肝癌发生发展。但TGF-β/SMAD信号通路在癌症发展的不同时期所起的作用完全相反,在癌症初期TGF-β/SMAD信号通路抑制癌症的发生发展,而当癌症发展到一定阶段TGF-β/SMAD信号通路又会促进肿瘤的发展。这样就会出现一个问题,在肝癌前期miR-590表达上调抑制了TGFβ/SMAD信号通路导致肝癌发生发展,但在肝癌后期miR-590抑制TGF-β/SMAD信号通路,对肝癌进展会不会有抑制作用呢?因此,肝癌后期miR-590对TGF-β/SMAD信号通路调控机制不清。研究发现,miR-590其中一个靶基因——程序性细胞死亡因子4(PDCD4)是一个重要的肿瘤抑制因子。人PDCD4基因定位于10q24,cDNA编码区约1.4kb,编码的蛋白约含469个氨基酸。大量的研究发现PDCD4基因是一种抑癌基因,通过影响癌细胞的增殖、转移或抗凋亡能力发挥其抗肿瘤效应。我们知道细胞异常增殖是癌症的一个主要特征,那由肝细胞异常增殖导致的肝癌,是否与miR-590及其靶基因PDCD4有关,两者是如何对肝细胞增殖发挥调控作用的,国内暂未见相关报道。研究目的：通过检测对比人正常肝细胞株L-02和肝癌细胞株、肝癌组织和癌旁组织中miR-590的表达情况,探讨miR-590在肝癌的发生发展中是否起着重要作用；结合术后随访结果分析miR-590是否影响肝癌患者的预后。采用MTT实验、软琼脂克隆形成实验、流式细胞术、Western Blot、荧光素酶报告系统及生物信息学等方法,从细胞水平及分子水平探讨miR-590如何调控肝癌的发生发展,阐明miR-590、PDCD4在肝癌发生发展过程中对细胞增殖的调控作用,为肝癌诊断、治疗新手段的开发提供实验参考依据。研究方法：1.检测miR-590在肝癌中的表达情况。主要采用Real-time PCR为检测手段,分析对比不同样品中miR-590的表达差异。(1)以12例新鲜肝癌和癌旁组织为实验对象,分析不同分期的肝癌组织中miR-590的表达情况,观察miR-590是否与肝癌的恶性程度相关；(2)在64例液氮冻存肝癌组织(南方医院)中检测miR-590的表达水平,按表达量高低分为miR-590高表达组和miR-590低表达组,结合患者随访资料进行生存分析,了解miR-590与病人预后的相关性；(3)观察miR-590在正常肝细胞和肝癌细胞中的表达差异。2.miR-590的生物学功能研究。以miR-590低表达和miR-590高表达的肝癌细胞株为实验模型,分别在两株肝癌细胞株上高表达miR-590和抑制miR-590表达,检测肝细胞的增殖与miR-590的表达量相关性。(1)利用MTT实验检测不同方法处理后肝癌细胞生长、存活情况；(2)利用软琼脂克隆形成实验检测不同方法处理后肝癌细胞的增殖能力变化；(3)利用流式细胞术检测不同方法处理后肝癌细胞在增殖时发生的细胞周期变化。3.研究miR-590是否直接结合PDCD4的3’UTR而抑制其蛋白翻译。(1)生物信息学分析miR-590靶基因的结合位点,筛选出候选靶基因PDCD4;(2)在miR-590的高、低表达组中分别选择MHCC97H、MHCC97L为实验对象,分别转染miR-590-inhibitor及miR-590,采用Western blot技术检测转染前后PDCD4蛋白表达量的变化,检验PDCD4的表达是否受miR-590的表达变化影响；(3)采用荧光素酶报告系统,在上述实验的基础上,更进一步地探讨miR-590是否直接与PDCD4的3’UTR结合抑制PDCD4的蛋白翻译。4. PDCD4对肝癌细胞增殖功能影响的重要性研究。(1)对MHCC97L分别转染miR-590、miR-590+PDCD4及miR-590+PDCD4-3’UTR,用克隆形成实验检测细胞增殖情况,检验PDCD4是否可以阻断miR-590对肝癌细胞增殖的促进功能,并进一步检验PDCD4是否受miR--590调控抑制；(2)Western blot技术检测7株肝细胞(1株正常肝细胞LO-2和6株肝癌细胞)中PDCD4的表达水平,结合之前检测各株肝细胞中miR-590的表达,分析肝癌细胞中miR-590的表达与PDCD4的表相关性。研究结果：1.miR-590在肝癌中高表达并对患者预后带来不良影响。(1)荧光定量PCR实验检测12对肝癌组织和癌旁组织的样品,结果发现miR-590在肝癌组织中高表达；(2)荧光定量PCR实验检测64例带有术后随访资料的冰冻肝癌组织样品,结果发现miR-590高表达预示较差的预后和更高的预后风险(p<0.01)；(3)荧光定量PCR实验检测对比正常肝细胞株和肝癌细胞株中miR-590的表达情况,结果发现miR-590在肝癌细胞系中高表达(p<0.05)。2.miR-590影响肝癌的增殖。(1)用MTT法检测6株肝癌细胞系HepG2、 MHCC97L、BEL-7402、MHCC97H、Huh7和Hep3B及一株正常肝细胞系LO-2的生长、存活情况,分析miR-590的表达与肝细胞存活的关系,结果发现miR-590的表达与肝细胞的存活率正相关；(2)在6株肝癌细胞系中选择miR-590表达量最低的MHCC97L及miR-590表达量最高的MHCC97H作为细胞模型,分别以MTT法、克隆形成实验检测高表达miR-590对MHCC97L和下调miR-590表达对MHCC97H的增殖影响,流式细胞周期实验分别检测高表达miR-590和下调miR-590表达对肝癌细胞周期的影响,结果发现高表达miR-590可以促进肝癌细胞的增殖,下调miR-590的表达可以抑制肝癌细胞增殖。3.miR-590直接调控PDCD4的翻译表达。(1)从Target Scan和PicTar对miR-590的target基因进行预测,显示miR-590可以强结合PDCD4的3’UTR；(2)使用Western Blot的方法检验MHCC97L-NC、MHCC97L-miR-590、MHCC97H-NC和MHCC97H-miR-590-in中PDCD4蛋白的表达情况,发现miR-590与肝癌细胞中PDCD4蛋白的表达负相关；(3)荧光素酶报告结果：转染miR-590mimic后荧光素酶的表达被抑制并存在剂量效应；而当miR-590的表达被抑制后,荧光素酶的表达增强(p<0.05),其效果与miR-590inhibitor的剂量正相关；miR-590与PDCD4的结合位点被突变后,荧光素酶的表达和对照组没明显区别。4. PDCD4在肝癌的发生发展中起着重要作用。(1)克隆形成实验结果表明PDCD4基因的过表达可以抑制miR-590高表达在肝癌中促进增殖的生物学功能；(2)结合荧光定量PCR和Western Blot结果发现肝细胞中PDCD4与miR-590的表达负相关(r=-0.617,p<0.05)。结论：miR-590在肝癌中高表达并且与肝癌恶性程度正相关,与患者生存时间负相关；miR-590的表达和肝癌细胞的增殖能力正相关；miR-590通过和PDCD4mRNA的3’UTR结合抑制其翻译表达；高表达PDCD4可以抑制miR-590在肝细胞中促增殖的能力；PDCD4和miR-590在肝细胞中表达负相关。综上所述,我们的研究结果表明,miR-590在促进肝癌癌细胞发生发展中发挥了重要的作用,提出miRNA直接抑制PDCD4基因促进肝癌细胞中的增殖。详细了解miR-590在肝癌发生进展中所起的作用,不仅会增加我们的对肝癌生物学知识的了解,而且可能为肝癌的临床治疗开创新的治疗策略。