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环糊精葡萄糖基转移酶（cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase）能够催化淀粉等葡萄糖聚合物进行环化反应,生成环糊精（cylcodextrin,CD）。由于环糊精在化工、医药、食品等领域存在巨大的应用价值,所以,对CGTase有很大需求。目前CGTase的生产存在2个问题:（1）表达量低。野生菌株中CGTase的表达量非常低,需要利用基因工程的方式提高表达量。（2）CGTase的产物特异性差。CGTase催化淀粉同时产生α-、β-、γ-CD,给后期分离纯化带来困难。因此,本课题在前期构建高效表达CGTase的毕赤酵母菌株的基础上,优化重组毕赤酵母利用无机盐培养基表达CGTase的发酵条件,提高CGTase的产量,然后采用固定化的方式改善CGTase的产物特异性。本课题的主要研究结果有:（1）依次从培养基组分、诱导条件和添加剂三方面优化重组毕赤酵母表达CGTase。首先,以磷酸盐缓冲液（PBS）和硫酸铵替换原培养基的磷酸和氨水,使β-CGTase和γ-CGTase活力从0分别提高至49.06 U/mL和3.84 U/m L。经过进一步优化,最后得到最佳的发酵条件为100 mmol/L PBS、1%甘油、1%硫酸铵、诱导温度30°C、诱导pH 6.5、8%接种量、1.5%甲醇添加量,并添加10 mmol/L的Tween 80。最终β-CGTase和γ-CGTase活力分别提高至122.03 U/m L和8.84 U/mL。（2）由于本研究的CGTase在高温下具有较高的产物特异性,β-CD比例高,所以,利用交联聚集体（cross-linked enzyme aggregates,CLEA）技术,在高温时将CGTase的高特异性构象固定,用于高纯度β-CD的生产。本研究确定的交联酶聚集体CLEA-CGTase的最佳制备条件为交联温度85°C、0.1%戊二醛、75 U/mL CGTase添加量、交联p H 9.0、交联时间10 min。CLEA-CGTase的β活性比γ活性更稳定。CLEA-CGTase在50°C下保温8 h和4°C下储存42 d后,β-CGTase剩余活力分别为47.9%和86.8%。酶促动力学参数表明β-CLEA-CGTase的底物亲和力、最大反应速度（Vm）和催化效率(Kcat/Km)分别为γ-CLEA-CGTase的4.0、4.7和18.7倍。同时,马铃薯淀粉转化实验也表明,高温固定化后的CLEA-CGTase具有较高的产物特异性,产物中β-CD的比例达87%以上。另外,β-CLEA-CGTase活力在连续转化6次后仍剩余25.9%,达到了降低CD生产成本的目的。（3）为了较为简便地回收催化反应后的CGTase,利用多巴胺在碱性溶液中可以自聚合的性质,将聚多巴胺（PDA）涂覆于Fe3O4磁性纳米颗粒表面,并通过聚乙烯亚胺（PEI）的修饰作用,将其丰富的活性基团加载于包裹了PDA的Fe3O4磁纳米颗粒表面,用于CGTase的固定化。首先确定载体制备的最佳条件为2.0 mg/mL多巴胺、聚合12 h,然后分别考察二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙酰丙酮和PEI对固定化CGTase催化特异性的影响。结果表明0.5%的PEI能改善特异性,且能显著提高CGTase的活力回收率。通过优化固定化条件,得到最佳固定化条件为加酶量300 U/g,固定化pH 6.0,固定时间18 h。固定化酶CGTase/PEI@PDA-Fe3O4的β-CGTase活性的最适反应温度由50°C提高到55°C,而γ-CGTase活力的最适反应温度不变。这有利于CGTase/PEI@PDA-Fe3O4在高温下的环化反应。且与游离CGTase相比,CGTase/PEI@PDA-Fe3O4的β-环化效率和γ-环化效率分别提高3.1倍和2.4倍。CGTase/PEI@PDA-Fe3O4的稳定性也得到提高,经55°C保温8 h和4°C储存42 d后,β-CGTase分别剩余38.29%和83.72%。另外,多批次转化结果表明CGTase/PEI@PDA-Fe3O4具有较好的重复利用性,经10次转化后,γ-CGTase活性完全损失,β-CGTase活力剩余19.05%。因此CGTase/PEI@PDA-Fe3O4对于节省CD的生产和后期的纯化成本具有非常重要的意义。本课题通过工程菌的发酵优化增加CGTase产量,利用固定化酶技术成功地提高了其重复利用率,并改善了CGTase的催化特异性,对于工业生产CD具有很好的借鉴价值。