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原发性肝癌在我国属于常见的恶性肿瘤,其发病率在世界上仅次于肺癌、胃癌、直肠癌,居第四,而死亡率位列世界第二名。肝癌的预后差,治疗棘手,是由于该病起病隐袭、进展迅速、早诊困难,大多数患者确诊时已经发生转移或已达到晚期。对于晚期肝癌,系统化疗是临床经常采用的姑息疗法,但是迄今为止,还未找到理想的化疗药物及方案。目前奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP,OXA,第三代的铂类化疗药物)是临床上的一线化疗药物。相关研究结果显示奥沙利铂可以抑制DNA的合成,其机制是通过产生水化衍生物作用于肿瘤细胞内DNA,形成链间和链内的交联,从而产生抗肿瘤活性。由于其对肿瘤细胞能起到较好的抑制作用,目前奥沙利铂不仅被用于结直肠癌等的治疗,也在肝癌的全身化疗治疗中也有着很好的应用。5-FU(Fluorouracil,5-FU)经过三十多年来的临床使用,已广泛用于肝癌、胃癌、卵巢癌、绒癌、恶性葡萄胎、结肠癌、直肠癌等恶性肿瘤的治疗.它是一种临床常用的抗代谢类抗癌药,是消化道恶性肿瘤的首选化疗药物。5-FU通过多种途径阻断肿瘤细胞内的RNA和DNA合成,发挥抑制肿瘤生长的作用。5-FU在体内转化为5-FU核苷(5-FUR)后,掺入RNA中干扰蛋白质合成,故对各期细胞都发挥着作用;5-FU还可通过抑制外切体复合物,从而影响细胞生存;5-FU最主要的抗肿瘤作用方式是在生物体内核糖磷酸化和核糖基化,转化成5F-dUMP(5-FU脱氧核苷酸),而抑制脱氧胸苷酸合成酶,阻止dUMP(脱氧尿苷酸)甲基化为dTMP(脱氧胸苷酸),而dTMP是DNA复制合成的必需原材料,可导致细胞凋亡和细胞周期停滞[1]。但在临床应用中发现,存在着5-FU易产生耐药性,肝癌细胞对5-FU敏感性不高[2]口服吸收不完全,毒副作用较大,中毒剂量与治疗剂量很接近等诸多缺点[3-4],然而高剂量时毒副作用大及对肝癌的疗效不足等缺点限制了其临床使用。因此探索新型的化疗方案以提高5-FU对肝癌细胞的敏感性成为了一个非常重要且紧迫的问题。新的蒽醌类抗肿瘤药表柔比星又叫表阿霉素,表柔比星相比多柔比星具有广谱且更有效的优点,它在氨基糖部分4位的羟基由原先的顺式变成了现在的反式,比阿霉素和柔红霉素,具有更低的毒性,在目前的临床上为同类药物的首选,并已被广泛使用[4]。它的主要作用机理是:通过插入dna相邻的碱基对间,与dna形成可逆的双螺旋结合,干扰转录的过程,抑制rna和dna的合成,以实现癌症治疗的目标[5]、朱晓东等[6]应用表柔比星联合5-fu+oxa方案对晚期胃癌作了评估。结果显示,与其他化疗方案相比,具有良好的耐受性和高效率,且毒性低。目的:我们通过体外实验,使用表柔比星联合5-fu和oxa,探讨三种药物联合是否能够增加肿瘤细胞的有效凋亡率及其可能相关机制,探索新的思路用于治疗肝癌,为临床肝癌抗肿瘤治疗提供基础提供理论依据。方法:1.细胞来源:人肝癌hepg2细胞株购买自上海美轩生物科技有限公司2.实验分组:设立表柔比星联合5-fu+oxa组、5-fu+oxa组、表柔比星组、空白对照组3.mtt法检测各干预组hepg2人肝癌细胞增殖活性的差异4.rt-pcr法测定各组对hepg2细胞bcl-2mrna、baxmrna表达影响的差异5.westernblot法测定各组对hepg2细胞bcl-2蛋白、bax蛋白表达影响的差异6.统计分析:统计数据使用spss17.0,分别用均数±标准差(x±s)的数据进行表示。多组之间的比较使用单因素方差分析法,两组之间的比较使用snk法,p<0.05则表示差异有统计学意义。结果:1.mtt法检测不同用药组间hepg2人肝癌细胞增殖的影响:先筛查出各药物48h的ic50做为联合用药的浓度分别为:表柔比星、5-fu及oxa的ic50分别为3.44umol/l,1.76mmol/l,6.89mmol/l。mtt法结果示,四组hepg2细胞分别进行药物干预48h后,各组的抑制率分别为29.80%(表柔比星+5-fu+oxa组)、22.19%(5-fu+oxa组)、14.86%(表柔比星组),差异有明显统计学意义(F=120.198,P<0.05)。表柔比星+5-FU+OXA组、5-FU+OXA组、表柔比星组与空白对照组比较,OD值均降低,各用药组均抑制HepG2肝癌细胞的增殖,差异均有统计学意义(P<0.05);而各干预组中表柔比星+5-FU+OXA组OD值最低,说明表柔比星与5-FU+OXA联合有效提高了对HepG2肝癌细胞增殖的抑制率。(表柔比星+5-FU+OXA组、5-FU+OXA组间、表柔比星组、空白对照组间的比较,P<0.05,差异具有统计学意义)。2.RT-PCR法测各干预组HepG2细胞中Bcl-2mRNA、BaxmRNA的表达:表柔比星+5-FU+OXA组、5-FU+OXA组间、表柔比星组与空白对照组比较,各干预组Bcl-2mRNA的表达均降低(F=27.392,P<0.05,差异具有统计学意义)、BaxmRNA均升高(F=70.490,P<0.05),其中表柔比星联合5-FU+OXA组、5-FU+OXA组、表柔比星组三组药物干预组中,表柔比星联合5-FU+OXA组的Bcl-2mRNA的表达最低,同时表柔比星联合5-FU+OXA组的BaxmRNA的表达最低(P<0.05,差异具有统计学意义)。3.Western Blot法检测各干预组HepG2细胞中Bcl-2蛋白、Bax蛋白的表达:予以空白对照组相比较,各用药组HepG2细胞中Bcl-2蛋白的表达均降低、Bax蛋白的表达均升高,且表柔比星联合5-FU+OXA组的蛋白表达最明显。表明随着药物的联合作用,Bcl-2蛋白的表达逐渐增高(F=816.418,P<0.05,各组差异有统计学意义)、Bax蛋白的表达逐渐降低(F=62.916,P<0.05,各组差异有统计学意义)。结论:HepG2人肝癌细胞在表柔比星联合5-FU及OXA三种药物的共同干预作用下,加速了肿瘤细胞的凋亡,其增值率明显降低,其联合作用机制可能通过抑制Bcl-2表达,从而促进Bax的表达来实现。