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背景:造血分化是造血干细胞经过定向分化最终成为多种类型成熟细胞的过程,其中红系分化是重要的组成部分。分化、成熟障碍是白血病的特征,一旦红系发育障碍,阻碍网织红细胞的形成,终末分化受到抑制,导致外周血有核红细胞增多,逐渐取代了正常的造血,并侵袭肝、肺等其他器官和系统,使患者出现恶性贫血、出血、感染和浸润的特征,最终发生死亡。白血病具有增殖失控、凋亡阻滞、造血功能抑制以及分化障碍等特征,是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)约占所有成人白血病的20%,一般具有BCR-ABL特征性的Ph染色体。K562是从CML女性患者胸水中建立的细胞系,具有干细胞特征,是人红白血病的一种细胞系,在行为上更像未分化早期多潜能的造血祖细胞,在体外经过多种化学诱导剂的作用,可被用作诱导分化的理想模型。MiRNAs异常表达与多种疾病尤其是癌症发生发展相关,近年来研究表明,miRNAs与造血细胞增殖、分化、血液系统疾病密切相关,在红系分化、增殖和红细胞成熟过程中发挥着重要的作用。miR-429是miR-200家族成员之一,其异常表达与肿瘤的发生、发展、转移、凋亡、耐药等密切相关。信号接头蛋白CRKL(v-crk sarcoma virus CT10 oncogene homologue(avian)-like)是CRK家族成员之一,包含一个SH2和两个SH3结构域。CRKL可通过SH2、SH3结构域招募信号通路分子参与细胞信号转导过程,进而影响细胞的分化、增殖、粘附、迁移、侵袭、凋亡等,起着信号开关的作用。本组前期研究结果表明:CRKL在CML初发患者骨髓样本中表达升高,且CRKL敲降后促进K562细胞红系分化,同时miR-429直接靶向CRKL-3′-UTR负性调控CRKL表达,且二者在肝癌样本中表达水平亦呈负相关。我们推测miR-429可能与红系分化相关。miR-429与白血病及红系分化的关系未有研究报道,本论文我们将通过在K562细胞中上调miR-429的表达来研究其对K562细胞红系分化的影响及初步机制。目的:1.检测miR-429、CRKL在CML患者骨髓样本中的表达水平及分析二者的相关性;2.验证miR-429、CRKL在K562细胞红系分化中的表达及相关性分析;3.明确miR-429过表达对K562细胞红系分化的影响;4.初步探讨miR-429调控红系分化作用机制。方法:1.qRT-PCR检测miR-429、CRKL在CML初发患者样本、初发-完全缓解(CR)、复发-CR配对样本中的表达,并分析二者的相关性;2.联苯胺染色法检测不同浓度Hemin对K562细胞红系分化的影响;3.MTT检测不同浓度Hemin对K562细胞增殖的影响;4.qRT-PCR检测Hemin诱导K562细胞红系分化过程中红系分化标志分子?-globin、ε-globin、α-globin和GPA的m RNA表达水平;5.qRT-PCR和Western blotting(WB)检测miR-429、CRKL在Hemin诱导K562细胞红系分化过程中的表达水平;6.人工合成miR-429 mimic及其NC,瞬时转染至K562细胞,上调miR-429表达;7.Hemin诱导K562细胞红系分化,联苯胺染色法检测miR-429表达水平变化对K562细胞中血红蛋白表达的影响;8.Hemin诱导K562细胞红系分化,qRT-PCR检测miR-429表达水平变化对K562细胞红系分化标志分子?-globin、ε-globin和GPA表达的影响。结果:1.与正常样本相比,miR-429在CML初发患者骨髓样本中低表达,CRKL在CML初发患者骨髓样本中高表达;2.在CML初发-CR及复发-CR配对样本中,完全缓解后miR-429表达呈上升趋势,CRKL表达呈下降趋势;3.miR-429与CRKL表达水平呈负相关;4.Hemin诱导K562细胞红系分化后,联苯胺染色阳性细胞比例随Hemin浓度升高及诱导时间延长而增多,具剂量、时间依赖性,但过高的浓度使大量细胞死亡;5.Hemin诱导K562细胞红系分化后,随Hemin浓度升高,抑制K562细胞细胞增殖能力增强,具时间、剂量依赖性,但过高的浓度会使细胞大量死亡;6.60μM hemin诱导K562细胞红系分化后,红系分化标志分子?-globin、ε-globin、α-globin和GPA表达水平升高,说明红系分化诱导成功;7.miR-429和CRKL在Hemin诱导的K562细胞红系分化过程中表达水平分别升高和降低且二者表达水平呈负相关;8.miR-429 mimic及其NC瞬时转染至K562细胞,miR-429成功高表达;9.miR-429过表达增加了联苯胺染色阳性细胞的比例,促进血红蛋白表达;同时促进了?-globin、ε-globin和GPA的表达。结论:1.miR-429在CML患者骨髓样本中低表达,在CR患者中表达上升;CRKL在CML患者骨髓样本中高表达,在CR患者中表达下降;两者表达水平在临床水平呈明显负相关;2.miR-429和CRKL在K562细胞红系分化过程中表达水平分别升高和降低,两者在细胞水平呈明显负相关;3.miR-429过表达促进K562细胞红系分化;4.miR-429可能靶向CRKL调控红系分化。