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一、研究背景手足口病and,foot,and mouth disease,HFMD)是由多种肠道病毒引起的急性传染病,以婴幼儿常见,多发生在5岁以下的儿童,以手、足、口腔发生疱疹为主要临床特征,少数患者可出现中枢神经系统、呼吸系统的损害,导致肺水肿、心肌炎、脑水肿、无菌性脑膜炎、急性迟缓性麻痹等,个别重症患者病情发展快,容易导致死亡,严重威胁患儿的身体健康和生命安全。山东省是手足口病的高发省份之一,1984年山东省枣庄市就第一次报告了手足口病暴发疫情。自2007年以后,聊城市手足口病发病率和重症病例发生率逐年增长,疫情急剧上升,对社会造成的危害极其严重。因此,阐明聊城市手足口病的流行病学特点及病原体特征,对本地区手足口病防控、降低发病率和病死率都具有重要的意义。二、研究目的本研究通过对2013年聊城市手足口病的流行病学特点及病原学特征的分析,了解聊城市手足口病的流行规律及特点,明确2013年引起聊城市手足口病的主要病原体,并对EV71和CVA16进行基因特征分析,进一步阐明其遗传进化规律及特点。为本市手足口病的预防和控制工作提供科学依据。三、研究方法1.采用描述性流行病学方法对2013年聊城市手足口病监测系统中的病例,进行流行病学特征分析。2.采用RT-PCR方法对2013年聊城市HFMD疑似病例标本进行核酸检测和病原鉴定,使用RD细胞和Vero细胞对部分核酸检测阳性标本进行病毒分离。应用RT-PCR方法对病毒分离产物进行鉴定,对鉴定为肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)的部分阳性病毒分离物,进行VP1编码区基因扩增及核苷酸序列测定。3.随机挑选3株不同临床类型的EV71病毒分离株进行序列测定,和其它基因型及亚型的代表株序列构建亲缘性进化树,对他们进行核苷酸和氨基酸同源性分析；随机选取9株CVA16病毒分离株进行序列测定,和其它各基因型及亚型的代表株序列构建亲缘性进化树,并进行核苷酸和氨基酸同源性分析。四、研究结果1.聊城市2013年HFMD的发病率,各年、月和县市之间不同,差异有统计学意义；发病高峰主要集中在4-8月,与往年相似,发病人群主要集中在1-10岁,尤其是5岁以下,占总发病人数的96.30%；发病率男性较高于女性,男女性别比例为1.77：1,差别具有统计学意义,同时高唐县人口的发病率比其他县市人口的发病率高(P<0.01)。2.2013年聊城市共检测手足口病病例标本961例,阳性747例,阳性率79.29%。其中EV71为74例,占阳性标本的9.91%,CVA16为130例,占17.40%；其它肠道病毒543例,占72.69%。其中2例重症病例均进行了病原学检测,经鉴定均为EV71阳性。3.应用BioEdit和MEGA4软件对3株EV71进行VP1核苷酸和氨基酸分析,发现其彼此间同源性较高,其核苷酸之间的同源性为95.9%～97.9%；氨基酸之间的同源性为99.3%～99.6%,这3株EV71毒株均属于C4a亚型。与U22521BrCr的核苷酸和氨基酸同源性分别为：81.8%～81.9%和94.2%～94.6%；与B基因型核苷酸和氨基酸同源性分别为：82.6%～85%和95.9%～97.6%；与C基因型核苷酸和氨基酸同源性分别为：86.1%～97.6%和96.6%～100%；而与C4基因亚型核苷酸和氨基酸同源性高达90.6%～97.6%和96.6%～100%；其中与C4a亚型的核苷酸和氨基酸同源性最高分别为：92.8%～97.6%和97.9%～100%；而与C4b亚型的核苷酸和氨基酸同源性分别为：90.6%～92.7%和96.6%～99.3%。应用BioEdit和MEGA4软件对9株CVA16进行VPl核苷酸和氨基酸分析,发现其彼此间同源性较高,其核苷酸之间的同源性为：97.7%-100%；氨基酸之间的同源性为：99.3%～100%,这9株CVA16毒株均属于B2b亚型。与U05876G10(原型株)的核苷酸和氨基酸同源性分别为：75.8%～76.2%和91.5%～91.9%；与B基因型核苷酸和氨基酸同源性分别为：88.8%～98.5%和96.6%～100%；其中与B2b亚型的核苷酸和氨基酸同源性最高分别为：92.8%～100%和96.6%～100%；与B2a亚型的核苷酸和氨基酸同源性分别为：90.5%～94.0%和98.3%-99.6%。五、结论1.2013年引起聊城市手足口病的主要病原体以其它肠道病毒为主、兼有EV71和CVA16参与致本病。引起手足口病重症病例均为EV71。2.经序列测定及比对发现,2013年聊城市EV71病毒流行株均为C4a亚型,CVA16病毒流行株均为B2b亚型,与国内其他地区报道相一致。3.聊城市自2007年开展病原学检测以来,EV71和CVA16交替出现,2010年以EV71为主,2011年转为CVA16为主,2012年又转回以EV71为主,2013年手足口病主要病原体类型为其他肠道病毒,手足口病的病原谱正在发生改变,应加强EV71、CVA16及其他肠道病毒的监测,密切观察,有助于更好地预防和控制手足口病。