哺乳动物的早期胚胎发育是指由受精卵发育到囊胚的过程,其在不同物种间表现出广泛的相似性,但在谱系分化和多能性建立以及转录因子的时空调控方面,存在物种特异性。目前,对于哺乳动物早期胚胎发育的研究主要局限于以小鼠为代表的模式动物,对大型哺乳动物的研究较少,这严重阻碍了人们对哺乳动物早期胚胎发育的深入认知。长非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)是一类长度超过200 nt,不具有编码蛋白功能的基因组转录产物,基于其相对位置可分为基因内lnc RNA(intragenic lncRNAs)和基因间lnc RNA(intergenic lncRNAs,linc RNA)。研究表明,lnc RNA可以在转录前、转录以及转录后等不同水平调节基因表达,参与转录调控、表观遗传修饰以及X染色体剂量补偿等多种生物学事件。虽然近年来有越来越多的报道解析lnc RNA在哺乳动物多能性干细胞和胚胎发育相关的功能机制,但是几乎所有的研究都集中在小鼠中。鉴于lnc RNA在不同物种间的保守性较差,因此有必要在其他哺乳动物中鉴定并且深入探究lnc RNA在早期胚胎发育过程的功能机制。猪是重要的肉用家畜,也是理想的生物医学模式动物及潜在的人类异种器官移植供体。有研究表明猪早期胚胎发育关键生物学事件与调控机制比小鼠等模式动物更类似于人类,因此深入解析猪早期胚胎发育机制对生物医学和畜牧学的发展具有重要意义。据此,本研究借助高通量单细胞转录组测序技术,构建猪卵母细胞以及合子到早期囊胚发育过程的转录组图谱,对猪早期胚胎发育过程中关键生物学事件进行解析,进一步对lncRNAs进行注释,深入解析了特定linc RNA对猪早期胚胎发育的调控机制。具体研究结果如下:(1)利用猪早期胚胎的转录组测序数据,我们共识别了19,813个基因,构建了猪早期胚胎的转录图谱,发现猪早期胚胎的转录组特征存在明显的阶段特异性,并且在合子基因组激活前后差异较大。通过对桑椹胚时期卵裂球进行层次聚类,我们鉴定了内细胞团(inner cell mass,ICM)和滋养层(trophoderm,TE)的前体细胞,发现CARM1、YBX3和RRAS在猪ICM谱系中存在特异性表达,而TEAD4、DAB2、NUDT4和CLDN8在猪TE谱系中存在特异性表达。进一步,通过对8-细胞到ICM的差异表达基因以及多能性相关调控因子的表达模式分析,我们发现在猪桑椹胚以及早期囊胚的ICM中存在显著的初始态多能性特征,而且发现多能性的建立与LIF/STAT3信号通路和能量代谢途径的活性相关,并明确ESRRB,TFCP2L1,UTF1和OTX2在猪ICM中存在特异性高表达,可作为猪初始态多能性的标记分子。通过对信号通路活性的分析,我们发现在ICM中LIF/STAT3、MAPK和PI3K-AKT信号通路活性较高,进一步通过免疫荧光检测,验证了LIF/STAT3信号通路在猪2-细胞胚胎和ICM中的高活性状态。我们通过对表观修饰因子表达的分析建立了猪早期胚胎表观遗传修饰的变化模式,发现4-细胞胚胎中,抑制性修饰如DNA甲基化和H3K9me3显著降低,而激活性修饰如H3K4me3明显上升,这与合子基因组激活的发生相一致。我们还通过Y染色体基因的表达情况对胚胎的性别进行区分,并对雌性和雄性胚胎X染色体连锁基因的表达水平进行分析,发现猪桑椹胚中雌性胚胎X染色体连锁基因表达量大致为雄性胚胎的2倍,而早期囊胚中这一比例有所下降,但雌性胚胎X染色体连锁基因表达量仍然略高于雄性胚胎。本研究对猪早期胚胎发育过程中转录组变化模式进行了鉴定,为猪早期胚胎发育的机制研究提供了理论基础,同时为猪多能胚胎干细胞的建立奠定基础。(2)我们接下来利用猪早期胚胎单细胞转录组测序数据进行lncRNAs的识别,一共鉴定出41,235条全新的lncRNAs,大部分(68%)为linc RNAs。通过对1-细胞期特异性高表达linc RNAs的敲低,我们发现linc-321的缺失会导致猪胚胎发育阻滞在1-细胞期,进一步发现,linc-321敲低会导致胚胎雌雄原核融合异常。Q-PCR结果显示linc-321敲低后MYT1表达量显著增高,证明linc-321对MYT1的表达具有抑制作用。RNA-FISH结果显示linc-321主要定位于细胞核中,暗示linc-321可能在转录水平调控MYT1的表达。Ch IP-PCR结果表明,linc-321敲低导致MYT1启动子区域H3K27me3修饰显著缺失。通过RPISeq预测发现linc-321与PRC2重要组分SUZ12可能存在特异性结合(PIP-SVM=0.93),进一步RIP-PCR证明SUZ12与linc-321间存在相互作用。上述结果表明,linc-321通过募集PRC2复合物在MYT1启动子区建立H3K27me3修饰,抑制MYT1表达,从而促进雌雄原核正常融合形成合子。本部分研究首次在猪早期胚胎中解析了lnc RNA的调控机制,为广泛的理解lnc RNA的功能奠定基础。综上所述,我们通过猪早期胚胎的单细胞转录组测序分析,建立了猪早期胚胎的表达谱,描述了猪早期胚胎发育过程中第一次谱系分化及多能性建立和相关调控机制,为猪早期胚胎发育的机制研究和胚胎干细胞的建立提供了理论基础。此外,我们对猪早期胚胎的lnc RNA进行了全面的注释,并探究了特定linc RNA的功能和调控机制,为lnc RNA在大型哺乳动物中的功能解析开启新的篇章。