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人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells,hESCs)拥有无限的自我复制与更新能力且能保持其分化成任何一种体细胞的多能性,在再生医学中具有广阔的应用前景。宿主对来源于hESCs的移植物的免疫排斥是阻碍其发展的关键性瓶颈之一。另一方面,当前抑制宿主免疫排斥的各种策略均会不可避免地增加hESCs及其移植物的癌变风险。
为了解决上述问题,本论文的研究目的是建立一株耐受宿主免疫排斥、癌变风险安全可控的人胚胎干细胞株,并初步探讨这种胚胎细胞潜在应用于心梗治疗中的可行性。利用细菌人工染色体同源重组基因编辑技术在hESCs的HPRTl位点上敲入CTLA4-Ig、PD-L1和TK这3个基因,建立了hESCs-CPTK。CTLA4-Ig和PD-L1的共同表达能诱导hESCs.CPTK及其衍生而来的细胞耐受免疫排斥,自杀基因TK的表达能使得hESCs-CPTK及其衍生而来的细胞可以在体外或体内被美国FDA批准的基因治疗药物更昔洛韦(Ganciclovir,GCV)所清除。
在一种具有人免疫系统的小鼠模型上验证了hESCs-CPTK的相关功能。流式细胞术和免疫荧光染色法的结果显示hESCs-CPTK在人源化小鼠体内形成的畸胎瘤的T淋巴细胞浸润率显著低于野生型hESCs形成的畸胎瘤,提示hESCs能耐受人源化小鼠的免疫排斥;小鼠体内来源于hESCs-CPTK的畸胎瘤能被腹腔注射的GCV所消除,表明hESCs-CPTK癌变风险安全可控。荧光定量PCR和流式细胞术结果表明hESCs-CPTK具有胚胎干细胞的多能性,且能在体外被诱导分化生成心肌细胞。免疫荧光染色法验证了人源化小鼠体内来源于hESCs-CPTK的心肌细胞耐受人源化小鼠免疫排斥的同时能通过腹腔注射GCV被消除。相对于小鼠,大鼠具有更大的体型,在心跳频率上与人类更接近,更适合应用于心梗研究。因此,建立了具有人免疫系统的大鼠模型、严重免疫缺陷的大鼠心梗模型及成功在心梗大鼠模型的心脏中移植了hESCs分化而来的心肌细胞,为后续进一步研究hESCs-CPTK对心梗的治疗作用奠定了基础。
本论文通过基因编辑技术,在诱导hESCs免疫耐受的同时降低了hESCs的癌变风险,并在具有人免疫系统的人源化小鼠上验证了这两种作用。hESCs.CPTK具有分化成为心肌细胞的能力,可以作为细胞来源潜在应用于心梗治疗。建立的相关大鼠模型将促进hESCs-CPTK治疗心梗的进一步研究发展。
为了解决上述问题,本论文的研究目的是建立一株耐受宿主免疫排斥、癌变风险安全可控的人胚胎干细胞株,并初步探讨这种胚胎细胞潜在应用于心梗治疗中的可行性。利用细菌人工染色体同源重组基因编辑技术在hESCs的HPRTl位点上敲入CTLA4-Ig、PD-L1和TK这3个基因,建立了hESCs-CPTK。CTLA4-Ig和PD-L1的共同表达能诱导hESCs.CPTK及其衍生而来的细胞耐受免疫排斥,自杀基因TK的表达能使得hESCs-CPTK及其衍生而来的细胞可以在体外或体内被美国FDA批准的基因治疗药物更昔洛韦(Ganciclovir,GCV)所清除。
在一种具有人免疫系统的小鼠模型上验证了hESCs-CPTK的相关功能。流式细胞术和免疫荧光染色法的结果显示hESCs-CPTK在人源化小鼠体内形成的畸胎瘤的T淋巴细胞浸润率显著低于野生型hESCs形成的畸胎瘤,提示hESCs能耐受人源化小鼠的免疫排斥;小鼠体内来源于hESCs-CPTK的畸胎瘤能被腹腔注射的GCV所消除,表明hESCs-CPTK癌变风险安全可控。荧光定量PCR和流式细胞术结果表明hESCs-CPTK具有胚胎干细胞的多能性,且能在体外被诱导分化生成心肌细胞。免疫荧光染色法验证了人源化小鼠体内来源于hESCs-CPTK的心肌细胞耐受人源化小鼠免疫排斥的同时能通过腹腔注射GCV被消除。相对于小鼠,大鼠具有更大的体型,在心跳频率上与人类更接近,更适合应用于心梗研究。因此,建立了具有人免疫系统的大鼠模型、严重免疫缺陷的大鼠心梗模型及成功在心梗大鼠模型的心脏中移植了hESCs分化而来的心肌细胞,为后续进一步研究hESCs-CPTK对心梗的治疗作用奠定了基础。
本论文通过基因编辑技术,在诱导hESCs免疫耐受的同时降低了hESCs的癌变风险,并在具有人免疫系统的人源化小鼠上验证了这两种作用。hESCs.CPTK具有分化成为心肌细胞的能力,可以作为细胞来源潜在应用于心梗治疗。建立的相关大鼠模型将促进hESCs-CPTK治疗心梗的进一步研究发展。