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【研究背景】乳腺癌是全球范围内女性发病率最高、危害最大的恶性肿瘤,每年新增病例高达160余万人,死亡约52万人。研究乳腺癌的发生机制至关重要。目前,越来越多的研究显示,miRNA的异常表达与乳腺癌的发生、发展密切相关。微小RNA(miRNA)是一类由19-25个核苷酸组成的非编码小RNA,广泛存在于植物、动物和病毒中。miRNA通过调控多种基因表达,参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生理过程,在肿瘤发生、发展中具有重要的作用。其中miR-100异常表达对肿瘤发生、发展的作用受到了人们广泛关注。miR-100位于11号染色体上,长度由22个核苷酸组成。有研究表明miR-100可以通过靶向不同分子如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、Polo样激酶(Polo-like Kinase 1,PLK1)和肌动蛋白依赖性染色质亚群调节因子5(SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily A member 5,SMARCA5)来调节细胞凋亡、自噬、增殖和迁移、干细胞自我更新和药物敏感性。课题组前期的研究发现miR-100在正常乳腺组织中较高,而在乳腺癌患者的癌组织标本中明显表达下调,因此,怀疑miR-100的缺失可能与乳腺细胞的恶性转化有关。【研究目的】探讨miR-100对正常乳腺上皮细胞恶性转化和乳腺癌细胞恶性表型的影响,并进一步探讨其分子机制是否与影响肿瘤细胞的“干性”表达和上皮间质转化有关。【研究内容】1.检测临床乳腺癌组织标本、正常乳腺上皮细胞MCF-10A、乳腺癌细胞MCF-7中miR-100的表达水平差异。2.用miR-100 minics和miR-100 inhibitor的慢病毒载体分别转染正常乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌细胞MCF-7,并用嘌呤霉素筛选建立稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株。检测慢病毒转染的稳定细胞株MCF-10A和MCF-7中miR-100的表达情况。3.用上述构建的稳定下调miR-100表达的MCF-10A和稳定上调miR-100表达的MCF-7细胞株来检测miR-100对正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响。具体包括:(1)通过平板克隆实验、MTT法、Transwell法、划痕实验分别检测miR-100对MCF-10A和MCF-7克隆形成能力、活力、侵袭、迁移能力的影响。(2)通过Western Blot、微球体形成实验和软琼脂集落形成实验检测miR-100表达对乳腺癌干细胞标志物CD44~+,CD24~-蛋白表达水平、肿瘤干细胞微球形成能力的影响。4.探讨miR-100对乳腺细胞行为发生调控作用的机制是否与上皮间质样转化有关:通过细胞形态学观察比较上皮表型和间质表型改变,通过Western blot检测miR-100对上皮样标志物E-cadherin、间质样标记物N-cadherin蛋白表达的影响。【研究结果】1.发现在正常乳腺组织和细胞系中MiR-100表达水平明显比乳腺癌组织和乳腺癌细胞中高,提示其有可能是乳腺癌发生发展过程中一种抑癌基因。2.成功构建了稳定下调miR-100表达的正常乳腺上皮细胞MCF-10A和上调miR-100表达的乳腺癌细胞MCF-7。3.miR-100对乳腺细胞的恶性行为有负调控作用:抑制其表达后乳腺细胞的增殖、侵袭恶性指标的上调;相反,上调其表达后对乳腺癌细胞的恶性行为有抑制作用,表现为增殖、侵袭等恶性指标的减弱。具体如下:(1)平板克隆结果显示,下调miR-100的表达,MCF-10A细胞克隆形成能力明显增强;而上调miR-100后,MCF-7细胞的克隆形成能力明显降低。(2)MTT结果显示,下调miR-100的表达,MCF-10A细胞活力明显增强;而上调miR-100后,MCF-7细胞的活力明显减弱。(3)侵袭实验结果显示:下调miR-100的表达,MCF-10A细胞的侵袭能力增强;而上调miR-100后,MCF-7细胞的侵袭能力明显减弱。4.miR-100对乳腺癌干细胞有负调控作用:在乳腺上皮细胞中上调miR-100表达后,对肿瘤干细胞有抑制作用,表现为:(1)下调miR-100的表达,CD44~+的表达增加,CD24~-的表达降低。而上调miR-100的表达,结果相反。(2)下调miR-100的表达,MCF-10A细胞微球形成和非锚定生长能力增加;而上调miR-100后,MCF-7细胞微球形成和非锚定生长能力降低。5.miR-100对乳腺细胞恶性表型的调控作用可能是通过上皮间质化(EMT epithelial mesenchymal transition)发生的:下调miR-100表达,MCF-10A细胞形态出现由上皮样转为间质样,间质样蛋白的表达增加,而上皮样蛋白表达降低;而上调miR-100,MCF-7细胞形态出现间质上皮样改变,间质样蛋白的表达降低,而上皮样蛋白表达增加。【结论】在乳腺上皮细胞MCF-10A中miR-100表达减少,能够导致乳腺上皮细胞的增殖、侵袭、克隆形成能力、乳腺癌干细胞水平等恶性表型增加,从而起到恶性转化良性细胞的作用,其机制可能与其缺失后细胞EMT的发生导致细胞干性转化有关。而在乳腺癌细胞中上调miR-100的表达能够抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭、克隆形成能力、侵袭能力、肿瘤干细胞活性等恶性行为,其机制也是与抑制EMT密切相关。以上结果提示:一方面miR-100作为一种抑癌基因,其缺失或功能抑制可能是乳腺癌发生的潜在重要分子机制;另一方面,在乳腺癌细胞中增加其表达有抑制肿瘤恶性行为的作用,提示其可以成为治疗乳腺癌的潜在有效靶点。