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鸽新城疫(Newcastle disease,ND)是严重危害养鸽业的病毒性传染病,其病原为鸽Ⅰ型副黏病毒(Pigeon Paramyxovirus typeⅠ,PPMV-1),又称为鸽新城疫病毒。在新城疫病毒(NDV)的基因分型中,PPMV-1虽然与目前常规疫苗毒株同处于classⅡ系中,但PPMV-1在系统进化发育树上形成了一个独立分支-基因Ⅵb型,而传统疫苗毒株属于基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型,与基因Ⅵb型抗原性差异较大,导致现有疫苗免疫鸽后保护效果不佳。反向遗传学操作技术可以对病毒基因组进行突变、缺失或外源基因插入修饰等,从而快速获得毒力致弱毒株,可用于研制基因Ⅵb型的鸽新城疫专用疫苗。鸽I型副黏病毒Pi/CH/LHLJ/110822(Pi110822)为2011年分离自黑龙江省(ICPI=1.19,MDT=63h),是我国目前鸽中流行毒株。Pi110822毒株基因组DNA已经完整地克隆至p UC18载体,基因组10176nt位置构建了遗传标记(Nhe I酶切位点)。本研究在此基础之上,将p UC18中的基因组通过In-Fusion技术亚克隆至p OLTV5载体中,构建了含有Pi110822全长基因组c DNA的质粒p OLTV5-0822FL,与辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞,拯救出了新城疫病毒r0822。鉴定结果表明,拯救病毒遗传标记存在,毒力、在鸡胚成纤维细胞和鸡胚上的生长特性与亲本毒相近,从而成功构建了Pi110822毒株的反向遗传操作平台。研究表明,新城疫病毒的F蛋白裂解位点的氨基酸组成是其毒力主要决定因素。依据这一特点,将p OLTV5-0822FL质粒中病毒基因组进行改造,分别构建了F蛋白裂解位点突变为疫苗株La Sota相应序列的重组质粒,以及Pi110822的F基因替换为La Sota F基因的重组质粒,并成功拯救出F蛋白裂解位点突变毒株(Pi110822-FCS)和F基因替换毒株(Pi110822-LAF)。鉴定结果表明,Pi110822-FCS毒株与Pi110822-LAF毒株的ICPI值均由亲本毒的1.19降低为0,MDT由63h增加为大于168h,表明两株拯救病毒的毒力降低,由中等毒力毒株变为弱毒株。Pi110822-FCS与Pi110822-LAF分别感染的第5、10、15、20代的鸡胚尿囊液测定HA效价,然后进行RT-PCR扩增测序,结果表明突变位点经20代连续传代仍稳定存在,具有遗传稳定性。为筛选免疫原性良好的鸽新城疫弱毒疫苗株,对两株弱毒株的安全性和免疫原性进行了初步评估。安全性评价试验结果表明,2株病毒的尿囊液原液免疫3日龄SPF鸡后,在观察的15天内未出现发病和死亡,安全性良好。由于鸽新城疫病毒(Ⅵ型)对鸡均为中等毒力或低毒力毒株,所以选用基因Ⅶ型强毒株NDV/HLJ/01/06株攻毒免疫的SPF鸡,Pi110822-FCS组发病率为72.72%(8/11),死亡率为54.54%(6/11),Pi110822-LAF组发病率为50%(5/10),死亡率为20%(2/10),对照组全部死亡。攻毒毒株为基因Ⅶ型,与免疫毒株(基因Ⅵ型)抗原性差异较大,仍能起部分交叉保护作用。将Pi110822-FCS灭活后免疫20日龄SPF鸡,两周抗体HI效价能达到7.5±1.12,三周时HI效价达到9.1±1,表明作为灭活苗可在鸡体内刺激产生高水平血清抗体。本研究还进行了Pi110822-FCS在鸽上的免疫保护试验,但由于鸽未完成净化,本身携带新城疫病毒,导致试验数据无法使用。以上实验结果综合分析表明,本研究所拯救的2株PPMV-1弱毒株,可以作为鸽用疫苗候选株继续研究。