食管癌是一种复杂的消化道恶性肿瘤,是世界上第六大癌症死亡原因,主要有食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)两种病理分型。在我国,主要以食管鳞癌为主,并呈现明显的地理性差异分布,其发病率高,治病因素多样,且预后差,易发生转移。食管鳞癌的一线化疗大多采用含铂或以氟尿嘧啶为基础的方案,然而,传统化疗药物毒副作用大,严重影响患者生活质量,并且常常出现耐药现象,治疗失败后患者的中位生存时间不到1年,预后极差。靶向药物治疗的确切疗效已经在部分消化道肿瘤(如结直肠癌和胃癌)中得到很好的验证,但食管鳞癌尚无有效的分子靶向药物,相关研究还处于探索阶段。因此,寻找有效的新型靶向药物,探索下游信号通路,并分析靶向治疗与传统化疗药物联用的潜在价值,将有望为食管鳞癌的治疗提供新思路。p97是三磷酸腺苷超家族中的一员,在细胞中广泛存在,参与了多种重要的细胞生物学过程,包括蛋白质稳态调控、自噬、染色质重塑、转录活性调节、免疫信号传导等。研究表明,p97能够通过辅助降解细胞内大量错误折叠蛋白,参与胞内蛋白质质量控制,保证细胞在蛋白质毒性压力下的存活。p97作为蛋白质量控制的关键组分,已成为抗癌靶向治疗的研究热点。研究表明,p97在非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤中高表达,且多与肿瘤浸润程度、组织学类型、病理分期等密切相关。抑制p97蛋白活性,能显著抑制非小细胞肺癌、结直肠癌、浆细胞癌等多种肿瘤的增殖。目前,针对p97抑制剂的筛选工作也已取得一定突破,DBeQ、NMS-873和CB-5083等抑制剂被相继报道。然而p97在食管鳞癌中的作用尚未引起关注,相关的文献报道较少。据此,本研究旨在从体内外水平研究p97抑制剂CB-5083单独或联合顺铂对食管鳞癌的抗肿瘤作用,并结合临床组织分析,阐明p97作为食管鳞癌治疗靶点的潜在价值,为食管鳞癌的化学治疗提供新思路和科学依据。方法:第一部分:CB-5083对食管鳞癌细胞表型及内质网应激途径的影响1.食管鳞癌组织和细胞中p97的表达情况收集临床手术切除的食管鳞癌组织及癌旁正常组织标本,qRT-PCR和免疫组织化学法检测临床标本中p97 mRNA和蛋白的表达,并采用qRT-PCR和Western blot检测食管鳞癌细胞中p97 mRNA和蛋白的表达。2.p97抑制剂对食管鳞癌细胞表型及内质网应激途径的影响选取3种p97抑制剂,CCK-8法筛选出其中对食管鳞癌细胞生长抑制作用最为显著的抑制剂(CB-5083),并明确其对食管鳞癌细胞的最适作用时间及浓度范围进行后续实验。EdU荧光法检测CB-5083对食管鳞癌细胞增殖的影响,FITC/PI双染法检测CB-5083对食管鳞癌凋亡的影响,流式细胞仪检测CB-5083对食管鳞癌细胞周期的影响,Transwell检测CB-5083对食管鳞癌细胞迁移的影响,Western blot检测CB-5083对癌细胞内质网应激途径相关蛋白表达的影响。第二部分:CB-5083联合顺铂对食管鳞癌细胞表型的影响EdU荧光法检测CB-5083联合顺铂对食管鳞癌细胞增殖的影响,FITC/PI双染法检测联合用药对食管鳞癌细胞凋亡的影响,流式细胞仪检测联合用药对食管鳞癌细胞周期的影响,Transwell检测联合用药对食管鳞癌细胞迁移的影响,Western blot检测联合用药对食管鳞癌内质网应激途径相关蛋白表达的影响。第三部分:体内实验研究CB-5083联合顺铂对食管鳞癌的抗肿瘤作用裸鼠随机分为四组,皮下注射食管鳞癌Eca109细胞,构建裸鼠移植瘤模型。待裸鼠移植瘤长到适合体积时,将荷瘤裸鼠随机分为四组(NC对照组、CB-5083组、顺铂组、CB-5083+顺铂组),进行给药治疗,每隔1 d测量裸鼠移植瘤的长、短径及裸鼠体重,绘制肿瘤生长曲线。4周后处死裸鼠并剥离移植瘤称重,计算移植瘤体积及抑制率。TUNEL法检测各组移植瘤组织中细胞凋亡情况,免疫荧光检测移植瘤组织中Bcl-2、Bax蛋白表达。研究结果第一部分:CB-5083对食管鳞癌细胞表型及内质网应激途径的影响1.p97在食管鳞癌组织和细胞中的表达在qRT-PCR检测的32对食管鳞癌组织样本中,22对食管鳞癌组织p97mRNA表达量显著高于癌旁正常组织;对另外30对食管鳞癌样本的免疫组化学检测结果发现p97高表达与食管鳞癌病理分级正相关;此外,与正常食管上皮细胞Het-1A相比,TE13、TE1、Eca109、Kyse70、EC9706细胞中p97蛋白表达明显上调,EC1细胞表达没有显著性差异。2.p97抑制剂对食管鳞癌细胞表型及内质网应激途径的影响选取p97抑制剂DBeQ、NMS-873和CB-5083,CCK-8法检测发现其中CB-5083对食管鳞癌细胞生长的抑制作用更显著。采用3个浓度梯度的CB-5083分别处理食管鳞癌细胞Eca109、Kyse70、TE1,结果发现随着药物浓度的增加,食管鳞癌细胞的增殖被明显抑制,细胞凋亡率逐渐上升,细胞周期被阻遏在G0/G1期,且细胞迁移率下降。此外,CB-5083作用后,食管鳞癌细胞中内质网应激相关蛋白p-EIF2α、PERK、Bip、Chop随着浓度的增加明显上调。第二部分:CB-5083联合顺铂对食管鳞癌细胞表型的影响CCK-8结果显示,CB-5083联合顺铂对食管鳞癌细胞生长的抑制作用具有协同效应。与CB-5083或顺铂单独用药组相比,联合用药组对食管鳞癌Eca109细胞增殖和迁移的抑制作用、对细胞凋亡的促进作用、对细胞周期的阻遏作用均更加显著。此外,联合用药组中内质网应激相关蛋白表达变化更为明显。第三部分:体内实验研究CB-5083联合顺铂对食管鳞癌的抗肿瘤作用裸鼠移植瘤实验结果表明,与对照组相比,CB-5083能够抑制裸鼠移植瘤的生长,而与单独用药组相比,联合用药组中移植瘤体积明显偏小,凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值下调更为显著;且细胞凋亡数增多。结论1.与癌旁正常组织相比,食管鳞癌组织中p97 mRNA和蛋白表达明显上调,且p97蛋白表达与食管鳞癌病理分级正相关。2.p97抑制剂CB-5083能明显抑制食管鳞癌细胞的增殖和迁移,促进食管鳞癌细胞凋亡,并将细胞周期阻遏在G0/G1期,CB-5083能显著上调内质网应激相关蛋白的表达。结果表明,CB-5083能够通过促进内质网应激途径抑制食管鳞癌细胞增殖,并促进其凋亡。3.与单独用药组相比,CB-5083与顺铂联合用药组能更显著的抑制食管鳞癌Eca109细胞的增殖和迁移,促进Eca109细胞的凋亡,并导致细胞周期紊乱。4.体内研究表明,CB-5083治疗组裸鼠移植瘤略小于对照组,而CB-5083与顺铂联合用药组对实体瘤的生长抑制作用更加显著。结果表明,CB-5083能够与顺铂发挥协同抗肿瘤作用。