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新城疫(Newcastle Disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)引起的严重危害养禽业的一种烈性传染病。新城疫病毒的基因组为不分节段、单股负链RNA。目前已经报道的NDV基因组全长有15186、15192和15198核苷酸(nucleotide, nt)三种形式。根据其基因组特性,新城疫病毒可分为I类(Class I)和II类(Class II)两种。Class I NDV在国际上少有报道,除了曾在爱尔兰发现强毒力的毒株外,其他仅在海、河岸边生活的禽类和健康家禽中分离到,且为无毒力或弱毒力。我国于2008年首次报道Class I NDV,此后多地也发现此类NDV。中国动物卫生与流行病学中心对2008年分离到的一株鸭源NDV弱毒NDV08-004株进行了全基因组序列的测定,通过NDV分子流行病学分析显示该分离株在分类地位上属于Class I,与近年来香港活禽市场分离株较为相似,同属于基因3型,并且发现P基因的非编码区比Class II NDV多出了12nt。为了解12nt出现的意义、鸭源NDV各基因的功能、NDV跨种间传播的机理、新型疫苗的研制以及不同类别NDV的差异和联系,可通过建立NDV反向遗传技术平台进行研究。本研究在NDV08-004株全基因组序列测定的基础上,构建了该基因组cDNA的全长克隆,以及该毒株的微型基因组转录载体和NP、P、L基因的三个真核表达质粒,通过病毒的体外包装技术,成功表达绿色荧光蛋白。1. NDV08-004株新城疫病毒的微型基因组以及NP、P基因辅助性质粒构建及鉴定参照GenBank上公布的鸭源NDV08-004株全基因组序列,设计NP、P基因的引物,通过RT-PCR方法从NDV08-004株NDV感染的尿囊液中扩增得到目的片段后,分别克隆进T载体pGEM-T Easy Vector中,再亚克隆到真核表达载体pCI-neo上,构建了NP、P基因的真核表达载体pCI-NP、pCI-P。质粒pCI-NP、pCI-P采用酶切、PCR方法鉴定的结果与预期大小一致;质粒pCI-NP、pCI-P各转染多个真核细胞48h后,通过间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence, IIF)试验能观察到明显的黄绿色荧光。这些结果表明辅助表达质粒pCI-NP、pCI-P具备在真核细胞中自动复制和转录功能。参照NDV08-004株全基因组序列和eGFP-C1质粒图谱,设计Leader、Trailer、GFP三对引物,其中Leader和GFP、GFP和Trailer之间互有对方的overlap部分,通过RT-PCR和普通PCR方法扩增得到目的片段,再通过overlap PCR方法将三者相连构成长度为1032bp的LGT片段,符合“六碱基规则”,再与经Sma I和Stu I酶切的转录载体pOLTV5连接,构建了NDV08-004株的微型基因组。2. NDV08-004株新城疫病毒的全基因组转录载体及L基因辅助性质粒构建根据NDV08-004株全基因组序列设计9对引物,通过RT-PCR方法从NDV08-004株NDV感染的尿囊液中扩增得到目的片段后,分别克隆进T载体pGEM-T Easy Vector中,再将这9对引物的扩增片段分别依次连接构建四个中间质粒LTP-T、ABC-T、DE-T、FG-T,再依次亚克隆到LGT-04质粒中,从而构建了含有NDV基因组cDNA全长的转录载体ND08004-pO。L基因分段引物E’的扩增片段克隆进T载体pGEM-T Easy Vector中,构建的质粒经Afl II和Sal I酶切回收后,与经同样酶切的全基因组中间质粒FG-T相连,构建了质粒L-T,再亚克隆到表达载体pCI-neo上,从而构建了L基因的真核表达质粒pCI-L。