[研究背景]结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)，也称大肠癌，包括结肠、直肠和阑尾的癌肿，它是世界上第三大常见的消化系统恶性肿瘤，每年在世界范围内会有655000人死于CRC[1]。CRC的发病率在不同地区具很大差异，以北美和大洋洲的发病率最高，而亚非地区较低。尽管我国是结直肠癌传统低发病率国家，但随着人们生活水平的提高、饮食结构的改变以及遗传因素的影响，我国结直肠癌发病率呈逐年上升趋势。据2012年肿瘤登记年报报道，我国结直肠癌发病率已跃居恶性肿瘤发病率第3位，死亡率已位居恶性肿瘤第5位[2]，在北京、上海、广州等大城市大肠癌发病率排在第2或3位。所以，寻找治疗CRC新的靶点，提高患者的生存质量，是研究CRC的关键所在。目前的研究认为，恶性肿瘤的侵袭转移过程包括：肿瘤细胞从原发灶脱离，穿过基底膜细胞外基质，迁移到周围血管和淋巴管，到达远处器官后与内皮细胞粘附，侵出血管外定植，形成转移灶[3]。在这个过程中，血管生成被普遍认为是肿瘤生长、侵袭、转移的关键因素之一，而血管内皮生长因子(VascularEndothelial Growth Factor，VEGF)则是促进血管生成中的关键因子[4]。VEGF是目前发现的作用最强的促血管生成因子，在肿瘤细胞和正常组织细胞均有表达。已有大量研究证实VEGF在包括卵巢癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌等恶性肿瘤表达增加，且与癌肿的血管密度、侵润转移和临床预后密切相关。越来越多的证据表明肿瘤微环境中的趋炎症反应与肿瘤的侵袭、转移密切相关。白介素-17(Interleukin-17，IL-17)是主要由新发现的一类T辅助细胞亚群Th17细胞所分泌的一种细胞因子，具有强烈的促炎症作用，是核心的炎症因子，积极参与多种炎症和自身免疫性疾病，在肿瘤的发生发展也起到重要作用[5]。但IL-17能否诱导肿瘤产生VEGF继而促进肿瘤的侵袭和转移，目前尚未见报道。为此，本实验将研究IL-17对结直肠癌血管生成的影响，初步探讨其可能分子学机制，为寻找抗肿瘤血管生成靶点提供新的依据。[研究目的]探讨IL-17对结直肠癌血管生成的影响及其可能分子学机制，为寻找抗肿瘤血管生成靶点提供新的依据。[研究方法]1、收集50例结直肠癌手术患者术后标本（癌组织、癌旁组织、正常组织），采用QRT-PCR和Western Blot方法检测IL-17mRNA、IL-17蛋白在结直肠癌组织中的表达情况。2、收集100例结直肠癌患者的病理切片，通过免疫组化方法，检测IL-17在结直肠癌组织中的表达情况，分析IL-17的表达与结直肠癌微血管密度（MVD）的相关性及与临床病理因素的关系。3、体外培养结肠癌细胞株（SW480、LOVO），分别加入50ng/L rhIL-17对其进行干预，CCK-8法检测IL-17对结肠癌细胞株增殖的影响；Transwell法检测IL-17对结肠癌细胞株的侵袭和迁移作用。4、体外培养结肠癌细胞株（SW480、LOVO），分别加入50ng/L rhIL-17对其进行刺激，QRT-PCR、Western Blot检测IL-17对结肠癌细胞株VEGF的表达影响。5、体外培养结肠癌细胞株（SW480、LOVO），分别加入50ng/L rhIL-17对其进行干预，QRT-PCR法检测JAK-STAT通路中JAK mRNA、STAT mRNA的表达情况，Western Blot法检测IL-17R、JAK、p-JAK、STAT、p-STAT蛋白的表达情况，ELISA检测通路上下游关键因子IL-6、IL-8的表达情况。[结果]1、在结直肠癌组织中，我们发现IL-17mRNA、IL-17蛋白的表达水平依次为癌组织＞癌旁组织＞正常组织，差异有统计学意义（P<0.05）。2、在结直肠癌组织中，IL-17的阳性染色呈棕黄色颗粒，主要分布于癌巢周围，100例结直肠癌组织病理切片中IL-17阳性表达有75例，阴性表达有25例，50例正常黏膜组织病理切片中IL-17阳性表达有16例，阴性表达有34例，IL-17在癌组织中表达显著多于正常组织（2=11.191，P=0.001）。以血管内皮标记物CD34染肿瘤血管内皮细胞，参考Weidner等人的方法，统计肿瘤MVD，然后分析其与IL-17表达的相关性，发现IL-17阳性表达组MVD值为15.60±3.65，IL-17阴性表达组MVD值为11.15±1.44，运用独立样本t检验统计得出结论：肿瘤MVD与IL-17的表达呈正相关(t=-5.920，r=0.567，P值为0.000)，继续分析IL-17的表达和MVD与临床病理因素的关系，发现IL-17的高表达与癌肿的侵润程度、TNM分期、是否有淋巴结转移有关（P＜0.05)），MVD与癌肿的分化程度、组织学类型、TNM分期有关（P＜0.05）。3、CCK-8实验表明，在无外源性IL-17刺激时，SW480和LOVO细胞能维持自主增殖状态，加入50ng/L的IL-17作用24h、48h、72h后，SW480和LOVO细胞表现出明显的促进增殖反应，SW480的细胞增殖率（%）分别为（1.18±0.07）%、（1.42±0.09）%、（1.62±0.08），LOVO细胞的增殖率（%）为（1.13±0.02）%、（1.32±0.05）%、（1.73±0.02）%，呈促进增殖趋势，与对照组比较有显著差异（P<0.05）。Transwell侵袭实验显示，在无IL-17作用下，几乎无穿膜细胞；IL-17作用两株细胞后，穿膜细胞数明显增加，IL-17作用SW480细胞24h后，侵袭能力明显增强，侵袭细胞数为（34.00±0.45），明显比对照组增多（t=-76.026，P=0.0012）；IL-17作用LOVO细胞24h后，侵袭能力明显增强，侵袭细胞数为（41.60±0.51），明显比对照组增多（t=-81.58，P=0.0047）。Transwell迁移实验显示，在无IL-17作用下，只有少许穿膜细胞；IL-17作用两株细胞后，穿膜细胞数明显增加，IL-17作用SW480细胞24h后，迁移能力明显增强，迁移细胞数为（36.40±0.0.51），明显比对照组增多（t=51.54，p=0.0034）；IL-17作用LOVO细胞24h后，迁移能力明显增强，迁移细胞数为（46.40±0.68），明显比对照组增多（t=49.26，P=0.0049）4、50ng/L rhIL-17对两株结肠癌细胞进行刺激后，QRT-PCR检测发现IL-17组VEGFmRNA表达上调（P＜0.05），Western Blot检测发现IL-17组VEGF蛋白表达上调（P＜0.05）。5、50ng/L rhIL-17对两株结肠癌细胞进行干预后，QRT-PCR检测发现IL-17组JAKmRNA、STATmRNA较对照组表达上调（P＜0.05），Western Blot检测发现IL-17组JAK、p-JAK、STAT、p-STAT蛋白较对照组表达量增加（P＜0.05），ELISA法检测细胞上清液IL-6、IL-8的表达情况，IL-17组高于对照组（P＜0.05）。[结论]IL-17在结直肠癌组织中的表达与肿瘤的恶性程度相关。IL-17促进肿瘤发生发展的可能机制是通过激活JAK-STAT信号通路，上调结肠癌细胞的VEGF，促进肿瘤血管的生成，进而促进肿瘤的增殖和侵袭转移。