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本研究通过诱导表达H5亚型禽流感病毒(AIV)血凝素基因(HA)重组蛋白，免疫6～8周龄BALB/c小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术进行脾淋巴细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，经有限稀释法筛选，得到5株能够稳定分泌抗AIVH5亚型血凝素蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为66-1、66-2、66-3、66-4、66-5。经鉴定，此5株单克隆抗体的免疫球蛋白亚型均为IgG1、Kappa链；腹水ELISA效价均达1∶105以上，且与H7亚型、H9亚型AIV及新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡产蛋下降综合征病毒(EDS-76V)、支原体等无交叉反应。通过免疫印迹(Western-blot)分析显示，它们都是针对AIVH5亚型血凝素蛋白的特异性单抗。
用纯化的AIVHA重组蛋白免疫新西兰大白兔，获得兔抗AIVH5亚型多克隆抗体，其琼扩效价达1∶16。将制备的单克隆抗体和多克隆抗体经饱和硫酸铵法粗提后再通过DEAE-纤维素柱进一步纯化，并经PEG8000包埋浓缩，使其浓度达5mg/mL以上。用改良过碘酸钠法对以上两种抗体分别进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，制备出酶标抗体，为H5亚型AIV夹心ELISA诊断方法的建立奠定了物质基础。
以纯化的抗AIVH5亚型HA蛋白单抗作为包被抗体，以兔抗AIVH5亚型HA蛋白酶标多抗作为第二抗体建立了用于检测H5亚型AIV的夹心ELISA方法。特异性检测表明，本实验建立的夹心ELISA方法与H7亚型、H9亚型AIV及NDV、IBV、IBDV、EDS-76V、支原体等无交叉反应；与针对阳性样本的病毒分离方法相比，两者符合率达100％。