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冠状病毒在自然界中普遍存在且广泛分布,具有胃肠道、呼吸道及神经系统嗜性,可引起严重的消化系统、呼吸系统和神经系统疾病。病毒识别并结合受体是病毒对细胞造成侵染的第一步,同时也决定着病毒的传染性和致病力。冠状病毒通过纤突蛋白(S)与细胞表面的受体结合入侵细胞,弄清病毒蛋白与细胞受体识别并结合的分子机制是研究开发抗病毒药物的基础。本课题以慢病毒(Lentivirus)和水疱性口炎病毒缺失糖蛋白(VSV-ΔG)假病毒系统作为工具,通过构建不同冠状病毒纤突蛋白的假病毒分析不同冠状病毒对细胞的感染效率,进而研究冠状病毒的受体识别机制。进一步通过活病毒感染试验,对猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)进行了重点研究,期望为深入研究冠状病毒受体识别及其入侵细胞的机制奠定基础。主要包括以下3个方面内容:1.构建了VSV-ΔG假病毒和VSV-ΔG-S重组假病毒利用水疱性口炎病毒(VSV)的感染性克隆系统,将基因组中的糖蛋白G替换成绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP),构建VSV-ΔG假病毒。该种假病毒可与其它糖基化蛋白发生重组,形成具有单一糖蛋白生物学功能的重组病毒。首先在293T细胞中瞬时表达冠状病毒纤突蛋白(S),24h后用MOI=3的VSV-ΔG感染细胞,24 h后收取VSV-ΔG-S重组假病毒。将构建好的VSV-ΔG-S假病毒感染不同种属的细胞系,分析比较不同冠状病毒S蛋白介导病毒感染细胞的效率。结果表明,与阳性对照VSV-ΔG-G相比,VSV-ΔG-S包装效率较低,因此尝试利用慢病毒假病毒系统进行研究。2.利用慢病毒假病毒系统研究不同冠状病毒的细胞入侵效率慢病毒载体是在HIV-1基础上改造而成的病毒载体系统。将慢病毒基因组表达质粒(p NL4-3 Luc R-E-)与冠状病毒S蛋白的表达质粒共转至293T细胞,构建假病毒,并感染表达相应受体的细胞。结果表明SARS-Co V-S假病毒的感染效率最高;MHV-S和HCo V-229E-S假病毒感染效率次之;TGEV-S和PEDV-S假病毒感染效率较高且相似;HCo V-OC43-S、BCo V-S和IBV-S假病毒对细胞的感染效果最弱且存在差异。PEDV-S和TGEV-S假病毒感染猪肾细胞(PK-15)、人肝脏细胞(Huh-7)、猴肾细胞(Vero-CCL-81)和犬肾细胞(MDCK),结果显示两种假病毒对PK-15、Huh-7和Vero-CCL-81细胞有感染性,对MDCK不具有感染性。3.PEDV和TGEV细胞嗜性的研究利用PEDV和TGEV活病毒分别感染PK-15(猪肾细胞)、Huh-7(人肝脏细胞)、Vero-CCL-81(猴肾细胞)和MDCK(犬肾细胞)4种细胞系。两种病毒均以MOI=0.5进行感染,同时加入10μg/m L胰酶促进病毒感染,在感染细胞24h后用间接免疫荧光法(Indirect immunoinfluscent assay,IFA)对病毒的侵染情况检测。结果表明PEDV、TGEV均可感染猪肾和猴肾细胞,而只有PEDV可感染人肝脏细胞,提示PEDV具有潜在跨种传播感染人的风险,值得引起关注。