1目的从临床与实验两个方面观察类风湿关节炎免疫球蛋白、生活质量、B淋巴细胞刺激因子、细胞因子、细胞自噬状态、PI3K-AKT-m Tor信号通路及相关实验室指标的变化,评价中药新风胶囊(Xinfeng Capsule,XFC)对其的影响,探讨XFC调节RA免疫球蛋白的作用机制。2方法2.1临床研究选60例RA患者均来自2013年7月—2014年7月安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科住院病人;所选病例均符合2009年ACR和EULAR提出的最新RA分类标准和评分系统。随机将其分组为新风胶囊组(治疗组)30例和来氟米特(对照组)30例,另设20例健康对照组,健康对照组来自安徽省中医药大学第一附属医院健康体检中心。采用生化分析仪检测基础生化指标及血常规,双抗体夹心酶联免疫吸附法检测RA患者外周血Ig G亚型(Ig G1、2、3、4)和B淋巴细胞活化因子(B cell-activating factor of the TNF family,BAFF),流式检测法检测RA患者外周血中B淋巴细胞活化因子受体(B cell-activating factor of the TNF family receptor,BAFF-R)CD19+CD45+CD268+表达频率情况;Western Blotting法检测RA患者外周血B淋巴细胞中微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)的表达;采用问卷量表观察RA患者生活质量及焦虑抑郁情绪;观察新风胶囊对RA患者的疗效、免疫球蛋白、BAFF/BAFF-R等影响。2.2实验研究将60只SD雄性大鼠随机分为正常对照(NC)组,模型对照组(MC组),新风胶囊治疗组(XFC组),来氟米特对照组(LEF组),雷公藤甲素对照组(TP组)每组12只。除NC组外,其余大鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂(FCA)0.1 ml致炎造模,第10 d在尾根部注射CFA 0.05 ml加强免疫,致炎后第19 d开始灌胃给药。各组的给药剂量如下:XFC组0.034g/1ml/100g,LEF组0.5mg/1ml/100g,TP组50ug/kg/100g,NC组、MC组予生理盐水灌胃9mg/1ml/100g;一天一次,连续用药30 d。观察各组大鼠体质量、足跖肿胀度、关节炎指数(AI);光镜下观察大鼠滑膜组织病理变化;双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)法观察AA大鼠血清细胞因子(IL-1、TNF-α、IL-4、IL-10)、Ig A/Ig G/Ig M、Ig G2a/Ig G1、BAFF水平;免疫组织化学法/免疫荧光法检测AA大鼠滑膜的Igκ与Igλ的比值;电镜观察AA大鼠脾脏、胸腺及滑膜中细胞自噬情况;荧光定量PCR法检测大鼠自噬相关基因(Atg5/Atg7/Atg12);Western blotting法检测大鼠滑膜、胸腺、脾脏B淋巴细胞中LC3、Beclin1、PI3-kinase p110δ、p-Akt1/2/3和m TORC1蛋白的表达及新风胶囊对以上指标的影响。3结果3.1临床研究结果3.1.1 RA患者免疫球蛋白及亚型的变化共检测20例正常人及60例RA患者的免疫球蛋白。与正常范围相比,Ig A高于正常范围(0.7-4.06g/L)的有15人,占全部患者的25%;Ig G高于正常范围(6.8-14.5 g/L)的有26人,占43.3%;Ig M(0.4-2.5 g/L)异常的有3人,占5%。与正常组比较,RA组免疫球蛋白Ig A、Ig G、Ig M均有升高,其中Ig G较明显(P<0.01)。与正常组比较,RA组Ig亚型均有明显提高,其中Ig G1的升高较为明显(P<0.01)。3.1.2 RA患者BAFF/BAFF-R的变化共检测20例正常人及43例RA患者的BAFF/BAFF-R的含量。与正常组比较,RA组BAFF/BAFF-R均有明显提高,其中BAFF-R的升高较为明显(P<0.01)。3.1.3 RA患者免疫球蛋白、Ig G亚型及BAFF/BAFF-R的相关性研究相关性分析显示,免疫球蛋白G的亚型Ig G1与BAFF-R呈负相关(P<0.05)。BAFF-R与WBC、PLT、CRP、RF、ASO均呈正相关,Ig A与CRP呈负相关(P<0.05或P<0.01)。关节疼痛、晨僵、皮下结节与Ig G均呈正相关(P<0.05);少气懒言、关节重着与Ig G1呈正相关;关节压痛与BAFF呈正相关。生活质量总积分与Ig G呈正相关(P<0.05),社会功能积分与Ig G3呈正相关(P<0.05)。DAS28与Ig A、Ig G均呈正相关(P<0.01);Ig M与SAS/SDS均呈正相关(P<0.05)。3.1.4新风胶囊治疗RA患者的临床疗效LEF组和XFC组在治疗第4周、第8周、第12周的ACR20分别为15%和25%、45%和60%、85%和85%,ACR50分别为5%和5%、10%和20%、40%和70%,ACR70分别为0%和0%、5%和5%、15%和25%,卡方检验P值>0.05,说明两组ACR20/70间的差异不具有统计学意义;ACR50 12周P<0.05,XFC组明显优于LEF组。3.1.5新风胶囊对RA患者免疫球蛋白的影响Ig A、Ig G、Ig M、Ig G亚型Ig G1,Ig G2,Ig G3,Ig G4两组药物治疗前后均未明显降低,但治疗12周后LEF组与XFC组Ig G1具有统计学差异(P<0.05),新风胶囊降低Ig G1的表达,而LEF则稍有升高(P>0.05)。3.1.6新风胶囊对RA患者BAFF/BAFF-R的影响BAFF两组药物治疗前后均未明显降低,但治疗12周后LEF组与XFC组BAFF数值具有统计学差异(P<0.05),12周后XFC组BAFF-R明显降低(P<0.01)。3.1.7新风胶囊对RA患者血清实验室指标的影响新风胶囊与来氟米特治疗前后HGB明显升高(P<0.01),PLT明显降低(P<0.05或0.01);LEF组ESR明显降低(P<0.01),CCP明显升高(P<0.05)。治疗12周后LEF组与XFC组各指标没有统计学差异。3.1.8新风胶囊对RA患者生活质量的影响两组治疗后中医症候体征积分各项及总积分均有明显降低(P<0.01或P<0.05)。与LEF组治疗后相比,XFC组治疗后少气懒言、大便稀溏、食欲减退明显降低(P<0.01或P<0.05);关节疼痛、肿胀、压痛、夜间疼痛、晨僵也稍有降低,但没有统计学差异(P>0.05)。两组治疗后生活质量积分均有明显降低(P<0.01或P<0.05)。与LEF组治疗后相比,XFC组治疗后社会功能、心理功能、健康自我认识能力改善更明显(P<0.01)。两组治疗后HAQ、DAS28、SAS、SDS均有明显降低(P<0.01或P<0.05)。与LEF组治疗后相比,XFC组治疗后SDS明显降低(P<0.01或P<0.05)。3.1.9 RA患者自噬标志物LC3-Ⅱ变化情况通过免疫印迹检测发现:与正常对照组比较,RA组患者外周血B淋巴细胞的LC3-Ⅱ表达降低(P<0.01或P<0.05)。3.2实验研究结果3.2.1 AA大鼠体质量、足趾肿胀度和AI变化及XFC对其影响致炎前各组大鼠体质量、足跖肿胀度及AI比较无统计学意义(P>0.05)。致炎后,大鼠右后足趾出现明显红肿,局部灼热;致炎后第2-3天肿胀加重;部分大鼠致炎趾局部可出现溃烂;第8-10天足趾肿胀度有所缓解;第12天前后,足趾出现再次肿胀;并可观察到部分大鼠出现对侧足趾肿胀,肿胀程度稍低于致炎趾。致炎第19日给药,给药前,与NC组比较,MC、XFC、LEF、TP组大鼠足趾肿胀度和AI均显著升高(P<0.01或P<0.05),MC组与各治疗组之间比较无差异(P>0.05)。连续给药30天,给药后,与NC组比较,MC组大鼠足趾肿胀度升高,体重明显降低(P<0.01);与MC组比较,各治疗组大鼠足跖肿胀度和AI明显降低,XFC组体重明显增加(P<0.05);与LEF对照组相比,XFC组体质量明显增加(P<0.05),足趾肿胀度与AI无明显差异(P>0.05);XFC组与TP对照组比较无显著差异(P>0.05)。3.2.2 AA大鼠关节病理形态学变化及XFC对其影响光镜下观察大鼠足趾关节HE染色病理切片:NC组大鼠关节滑膜组织结构清晰,滑膜无增生、突起,少量炎细胞浸润;细胞分界清楚,分层较少(1~2层);关节面平整无损伤,关节软骨、软骨下骨结构完整。与NC组比较,MC组大鼠关节滑膜可见大量炎性细胞浸润,滑膜血管翳增多;滑膜组织增生,呈绒毛状突起至关节腔内;滑膜衬细胞分层增多(4~5层)并增厚;关节面模糊,部分关节软骨表面毛糙或缺如,部分关节软骨可见血管翳形成。药物干预后,XFC组大鼠关节滑膜、血管壁可见少量炎细胞浸润,部分滑膜组织嵌入关节腔内;滑膜衬细胞分层达2~3层,关节面较规整。与XFC组比较,LEF对照组大鼠滑膜衬细胞增厚,分层达2~4层;关节面较模糊,部分关节软骨可见血管翳形成;TP组大鼠关节可见滑膜及其周围组织少量炎性细胞浸润,滑膜血管增多,血管翳增生,滑膜衬细胞增厚,分层明显,关节面欠规整,部分关节软骨及软骨下骨破坏。3.2.3 AA大鼠血清细胞因子IL-1、IL-4、IL-10、TNF-α的变化及XFC对其的影响与NC组比较,MC组IL-1β、TNF-α明显升高,IL-4、IL-10明显降低;与NC组比较,各治疗组IL-1β、TNF-α无明显差异,IL-4、IL-10明显降低;与模型组相比,LEF组与XFC组IL-1β、TNF-α明显降低;LEF组、XFC组和TP组IL-4、IL-10明显升高;与LEF组比较,XFC组的IL-4明显升高;TP组TNF-α明显升高;与XFC组比较,TP组TNF-α、IL-10明显升高,IL-4明显降低。差异具有统计学意义(P<0.05或0.01)。3.2.4 AA大鼠血清免疫球蛋白及亚型Ig G1、Ig G2a、BAFF、κ、λ及比值的变化及XFC对其的影响与NC组比较,MC组BAFF、Ig G、Ig G1、Ig G2a明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。与MC组比较,各治疗组BAFF、Ig G、Ig G2a、Ig G2a/Ig G1明显下降,Ig M明显上升,LEF组Ig G1明显上升,XFC组则明显下降;Ig A无明显差异(P<0.01或P<0.05)。与LEF组比较,XFC组和TP组对BAFF、Ig G、Ig G2a的改善作用优于LEF组,而LEF组对Ig G1的升高作用更好(P<0.01或P<0.05)。XFC组与TP组无统计学差异。与NC组比较,MC组滑膜中Ig G轻链λ明显升高,κ、κ/λ明显降低(P<0.01或P<0.05)。与MC组比较,XFC组κ、κ/λ明显升高(P<0.05),LEF组无统计学差异。与LEF组比较,XFC组κ/λ明显升高(P<0.05)。XFC组与TP组无统计学差异。3.2.5 AA大鼠滑膜、脾脏、胸腺自噬小体的变化及XFC对其影响电镜下所见:NC组滑膜细胞线粒体无变形、肿胀,粗面内质网丰富,核膜边界清楚,染色质分布均匀,嵴突排列规整,可见含有细胞器的双膜结构的自噬体及多个自噬溶酶体;MC组滑膜细胞呈变形、肿胀,线粒体肿胀肥大并破坏,粗面内质网减少、破坏,核膜不完整,边界不清,染色质分布不均,嵴突排列不规整、部分消失,自噬泡较少且小,形状不规则。治疗组核膜清晰,线粒体肿胀不明显,粗面内质网尚完整,自噬体及自噬溶酶体稍有增加。电镜下所见:NC组脾脏、胸腺组织线粒体无变形、肿胀,粗面内质网丰富,核膜边界清楚,染色质分布均匀,嵴突排列规整,可见含有细胞器的双膜结构的自噬体及多个自噬溶酶体;MC组脾脏组织界限不清晰,细胞器破坏严重,自噬泡较少且小,形状不规则。LEF组、XFC组和TP组组织界限尚可分辨,自噬体及自噬溶酶体稍有增加。3.2.6 AA大鼠滑膜、胸腺、脾脏组织自噬相关基因ATG5/7/12 m RNA表达变化及XFC对其的影响与NC组比较,MC组滑膜Atg5 m RNA、Atg12 m RNA明显降低,Atg7m RNA无明显差异;脾脏Atg5 m RNA明显降低,Atg7 m RNA、Atg12 m RNA明显升高;胸腺Atg12 m RNA明显升高,Atg5 m RNA、Atg7 m RNA无明显差异(P<0.05或0.01)。与MC组比较,LEF组滑膜Atg5 m RNA、Atg12 m RNA明显下降,Atg7m RNA明显上升;脾脏Atg5 m RNA、Atg7 m RNA、Atg12 m RNA明显下降,胸腺Atg5 m RNA明显下降,Atg7 m RNA、Atg12 m RNA无明显差异;XFC组滑膜Atg12 m RNA明显下降,Atg5 m RNA、Atg7 m RNA无明显差异;脾脏Atg5 m RNA、Atg7 m RNA、Atg12 m RNA明显上升;胸腺Atg5 m RNA明显上升,Atg7 m RNA明显下降,Atg12 m RNA无明显差异。TP组滑膜Atg7m RNA、Atg12 m RNA明显下降,Atg5 m RNA无明显变化;脾脏Atg5 m RNA、Atg7 m RNA、Atg12 m RNA均明显下降;胸腺中Atg5 m RNA、Atg7 m RNA明显下降,Atg12 m RNA明显上升(P<0.05或0.01)。与LEF组比较,XFC组的滑膜的Atg5 m RNA、Atg12 m RNA明显升高,脾脏的Atg5 m RNA、Atg7 m RNA和Atg12 m RNA明显上升,胸腺的Atg5m RNA、Atg12 m RNA明显升高,Atg7 m RNA明显降低。TP组滑膜Atg7 m RNA明显下降,Atg12 m RNA明显上升;脾脏的Atg5 m RNA、Atg7 m RNA、Atg12m RNA明显上升;胸腺中Atg5 m RNA、Atg7 m RNA明显下降,Atg12 m RNA明显上升(P<0.05或0.01)。与XFC组比较,TP组滑膜Atg7 m RNA明显下降,Atg12 m RNA明显上升;脾脏Atg5 m RNA、Atg7 m RNA明显下降,Atg12 m RNA明显上升;胸腺Atg5 m RNA、Atg7 m RNA明显下降,Atg12 m RNA明显上升(P<0.05或0.01)。3.2.7 AA大鼠滑膜、胸腺、脾脏组织自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表达变化及XFC对其的影响在滑膜组织中,与NC组比较,MC组LC3-Ⅱ、Beclin1明显下降(P<0.01);与MC组比较,LEF组和XFC组、TP组LC3-Ⅱ、Beclin1明显升高(P<0.01或P<0.05);与LEF组比较,TP组LC3-Ⅱ明显降低(P<0.01),XFC组LC3-Ⅱ、Beclin1无明显差异;TP组LC3-Ⅱ比XFC组明显降低(P<0.01),Beclin1无统计学差异。在脾脏组织中,与NC组比较,MC组LC3-Ⅱ、Beclin1明显下降(P<0.01);与MC组比较,LEF组和XFC组、TP组LC3-Ⅱ、Beclin1明显升高(P<0.01或P<0.05);与LEF组比较,TP组Beclin1明显降低(P<0.01),XFC组LC3-Ⅱ、Beclin1无明显差异;TP组与XFC组LC3-Ⅱ、Beclin1无统计学差异。在胸腺组织中,与NC组比较,MC组LC3-Ⅱ、Beclin1明显下降(P<0.01);与MC组比较,LEF组和XFC组、TP组LC3-Ⅱ、Beclin1明显升高(P<0.01);与LEF组比较,TP组、XFC组LC3-Ⅱ、Beclin1无明显差异;TP组与XFC组LC3-Ⅱ、Beclin1无统计学差异。3.2.8 AA大鼠滑膜、胸腺、脾脏组织PI3K/AKT/m Tor的表达及XFC对其的影响在滑膜组织中,与NC组比较,MC组PI3K、AKT、m Tor明显上升(P<0.01)。与MC组比较,LEF组和XFC组、TP组PI3K、AKT、m Tor明显降低(P<0.01);与LEF组比较,XFC组与TP组PI3K、m Tor明显上升(P<0.01或P<0.05);TP组较XFC组PI3K明显升高(P<0.05)。在脾脏组织中,与NC组比较,MC组PI3K、AKT、m Tor明显上升(P<0.01)。与MC组比较,LEF组和XFC组、TP组PI3K、AKT、m Tor明显降低(P<0.01);与LEF组比较,XFC组PI3K、AKT明显上升,TP组AKT明显上升(P<0.01或P<0.05);TP组较XFC组PI3K明显升高(P<0.01)。在胸腺组织中,与NC组比较,MC组PI3K、AKT、m Tor明显上升(P<0.01)。与MC组比较,LEF组和XFC组PI3K、AKT、m Tor明显降低,TP组AKT、m Tor明显降低(P<0.01或P<0.05);与LEF组比较,TP组PI3K、m Tor明显上升(P<0.01或P<0.05),XFC无明显差异;TP组较XFC组PI3K、AKT、m Tor明显升高(P<0.01或P<0.05)。4结论4.1 RA患者免疫球蛋白Ig A、Ig G、Ig M升高,尤以Ig G为主,其升高与BAFF/BAFF-R的表达上升有关;4.2 XFC能够显著调节RA患者中医症状体征积分值、生活质量及抑郁积分值积分值;4.3 XFC能显著提高RA患者外周血中免疫球蛋白和Ig G1水平,改善患者免疫功能,优于对照组;4.4 XFC能显著降低RA患者BAFF-R的表达;4.5 XFC对AA大鼠的体质量增长无不良影响,在体质量增长和存活率方面优于对照组;在改善大鼠足跖肿胀度,降低关节炎指数方面与对照组无差异;4.6 XFC能降低AA大鼠BAFF、Ig G、Ig G2a、Ig G2a/Ig G1水平,增高Ig M、Ig G1水平;升高AA大鼠滑膜κ、κ/λ水平,提高血清细胞因子IL-4、IL-10水平,降低-1β、TNF-α水平及调节滑膜、脾脏、胸腺组织的自噬相关基因、特异性蛋白以及调节PI3K/AKT/m Tor信号通路,降低AA大鼠细胞自噬水平。4.7 XFC改善RA患者免疫球蛋白作用机制4.7.1通过诸药的联合作用调节细胞免疫及体液免疫功能,降低体液免疫活化,分泌免疫球蛋白发挥免疫抗炎作用;4.7.2通过下调BAFF的表达,抑制浆细胞分泌免疫球蛋白,减低免疫球蛋白水平;4.7.3通过上调Atg5 m RNA、Atg7 m RNA、Atg12 m RNA、LC3-Ⅱ、Beclin1的表达,上调机体细胞自噬水平,维持外周免疫耐受,调控细胞因子的分泌平衡,抑制淋巴细胞、免疫复合物过度分泌和浸润关节滑膜,降低免疫球蛋白水平,缓解关节破坏;4.7.4通过调节PI3K/Akt/m TOR通路,提高体内的自噬水平的同时提高Foxp3水平,降低BAFF刺激B淋巴细胞活化分泌免疫球蛋白。