长石莼(缘管浒苔)rbcL全长基因克隆与序列分析及主要漂浮种ITS及rbcL序列分析

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本文主要对长石莼(缘管浒苔)(Ulva linza)光合作用第一个关键酶核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase,E.C.4.1.1.39,简称Rubisco)大亚基全长基因(rbcL)及其侧向调控序列进行了克隆和序列分析,进而对该基因在不同光照条件下的表达差异进行了研究,为进一步研究浒苔快速生长的分子机制奠定一定基础。同时利用rbcL序列结合ITS序列对浒苔系统进化进行研究。 首先应用RT-PCR技术结合RACE(cDNA末端快速扩增技术),获得缘管浒苔rbcL基因全长cDNA序列。序列全长1472bp,其中包括1425bp的编码区序列及47bp的前导序列(NCBI登录号:DQ813496),编码474个氨基酸。缘管浒苔rbcL基因5’端的前导序列远比高等植物的短且不含有高等植物rbcL前导序列中普遍存在的SD序列(GGAGG)。此外,缘管浒苔rbcL基因前导序列在翻译起始位点ATG前为一段富含A/T的序列。根据推导的氨基酸序列预测了缘管浒苔Rubisco酶大亚基的二级、三级结构。其二级结构,包括199个α-螺旋、52处延伸直带及210处自由卷曲;预测的三级结构与二级结构有一定的相似性,推测与其功能域密切相关。 利用基因组步移技术,获得缘管浒苔rbcL基因DNA序列。序列全长2124bp(NCBI登录号:DQ813497),其中编码区序列长1425bp,为单外显子基因;5’非翻译区序列长225bp,转录起始位点为位于翻译起始密码子ATG上游第47个核苷酸G,在距离转录起始位点-9bp~-48bp的范围内有推测的类似原核生物的启动予序列(-10区:TAAAAT、-35区:TTGAAA);3’非翻译区序列长474bp,在距离转译终止密码子TAA下游54bp~98bp处有一段较长的回文序列,可形成一个22bp的茎结构。密码子偏好性分析结果表明,长石莼(缘管浒苔)rbcL基因偏向使用第三位核苷酸碱基为A和T的密码子。 Rubisco为光合作用第一关键酶,其表达与活性直接与植物光合速率、生长速度及产量具有重要关系。利用实时定量PCR技术,通过相对定量法对缘管浒苔在不同光照条件处理下rbcL基因表达情况进行了研究。研究表明:缘管浒苔rbcL基因的表达受光的调控,且在低光强下基因的表达丰度高于在高光强下的表达丰度。 2008年6-7月在青岛近海海域再次发生大量浒苔漂浮现象,并且江苏连云港、如东近海海域也发生了浒苔漂浮现象。从三地采集的浒苔样品基因组DNA获得rbcL序列及ITS序列,进行序列分析,并与采自上海金山海区的浒苔样品进行了比较。序列分析结果表明,青岛、连云港、如东海域主要漂浮种类是同一种浒苔。利用rbcL基因对浒苔样品系统发育分析,与ITS基因建树结果一致,青岛、连云港、如东海域的浒苔样本中绝大多数样本聚在一起,并且与U.linza,U.prolifera和U.procera亲缘关系较近,而与采自上海金山海区的浒苔样品(W01,W02,W04)的亲缘关系较远。提示2008年青岛出现的漂浮浒苔与连云港、如东近海海域的漂浮浒苔存在一致性。
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