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研究内容与目的:本课题旨在探究CD24分子在四氯化碳(Carbon Tetrachloride,CCl4)所诱导的小鼠肝纤维化发生的调节作用及其细胞学基础。本实验的研究内容主要分为以下四个部分:一、建立CCl4所诱导的小鼠肝纤维化模型,观察小鼠肝纤维化后CD24分子在肝组织中的变化;二、探究CD24分子对小鼠肝纤维化的调节;三、检测CD24分子在不同免疫细胞中的表达,观察CD24分子对肝内巨噬细胞的调节;四、解析CD24分子对巨噬细胞亚型的调节及分子机制。研究方法和结果:本课题分为四个部分研究:第一部分建立CCl4所诱导的小鼠肝纤维化模型,观察CD24分子在肝脏组织中的变化,包括两部分实验:1.构建小鼠肝纤维化的模型:小鼠腹腔注射CCl4六周,H&E染色观察小鼠肝组织损伤情况,血清学方法检测ALT(谷丙转氨酶)表达水平。Sirius Red染色检测小鼠的肝脏组织中的胶原纤维沉积,Real-time PCR方法检测肝组织中的α-SMA,Col1a1表达。结果显示:小鼠腹腔注射CCl4六周后,H&E染色中小鼠肝组织中的炎性细胞浸润增多,ALT表达增高;Sirius Red染色发现胶原纤维在肝组织中增多;Real-time PCR方法检测到肝脏组织中α-SMA,Col1a1表达升高。成功构建了小鼠肝纤维化的模型。2.检测肝纤维化小鼠的肝组织中CD24分子表达:Real-time PCR方法检测肝纤维化小鼠肝组织中CD24分子的表达,Western Blot检测在肝组织中α-SMA、CD24分子蛋白水平表达。结果显示:在CCl4所诱导的小鼠肝纤维化模型中,肝组织中CD24 mRNA表达水平明显升高,同时,Western Blot检测CD24分子也升高。因此,CCl4所诱导小鼠肝纤维化后,在肝组织中CD24分子表达升高。第二部分探究CD24分子对小鼠肝纤维化的调节,包括两部分实验:1.肝组织病理学评估WT和CD24-/-小鼠肝纤维化的变化:野生型(WT)小鼠和CD24基因敲除小鼠(CD24-/-)注射CCl4后,H&E染色和谷丙转氨酶(ALT)评估肝损伤情况;Sirius Red染色评估肝组织中的胶原纤维。结果显示:H&E染色观察到:在CD24-/-小鼠的肝组织中,其炎性细胞的浸润明显多于WT小鼠,血清中ALT表达水平也明显升高。Sirius Red染色结果显示:CD24-/-小鼠肝组织中胶原纤维多于WT小鼠。因此,从肝组织病理学得出,野生型(WT)小鼠和CD24基因敲除小鼠(CD24-/-)同时腹腔注射CCl4后,CD24-/-小鼠肝损伤和肝纤维化程度更为严重。2.基因表达和蛋白水平评估WT和CD24-/-小鼠的肝纤维化:Real-time PCR方法检测肝组织中α-SMA,Col1a1的表达;Western Blot检测WT和CD24-/-小鼠肝组织中,α-SMA蛋白水平的变化。结果显示:CD24-/-的肝纤维化小鼠中,Real-time PCR方法检测到肝组织α-SMA、Col1a1肝纤维化指标都明显高于WT小鼠,同样,Western Blot检测α-SMA也高于WT小鼠。从基因表达和蛋白水平得出:CD24基因敲除后,CCl4处理的小鼠肝纤维化指标都高于WT的肝纤维化小鼠。第三部分检测CD24分子在不同免疫细胞中的表达,观察CD24分子对肝内巨噬细胞的调节,包括三部分实验:1.WT小鼠肝纤维化后,流式细胞术检测不同免疫细胞上CD24分子的变化。结果显示:WT小鼠肝纤维化后,相比其他免疫细胞,巨噬细胞表面的CD24分子升高明显。2.流式细胞术检测WT和CD24-/-肝纤维化小鼠肝内巨噬细胞的变化。结果显示:流式细胞术分析表明肝纤维化发生后,CD24-/-小鼠的巨噬细胞明显多于WT小鼠。3.应用注射氯氟松消耗掉小鼠的肝脏巨噬细胞后,评估小鼠的肝纤维化程度。结果显示:小鼠肝脏内巨噬细胞消耗后,Sirius Red染色发现,小鼠肝脏内胶原纤维减少;Real-time PCR检测Col1a1 mRNA降低;说明:小鼠肝纤维化程度减弱。第四部分解析CD24分子对巨噬细胞亚型的调节及分子机制,包括两部分实验:1.检测肝纤维化小鼠肝组织中TGF-β1的表达。结果显示:Real-time PCR检测发现在CD24-/-小鼠肝组织中TGF-β1 mRNA的表达明显高于WT小鼠。2.检测TGF-β1在巨噬细胞不同亚型中的表达及分泌:LPS和IL-4分别刺激WT和CD24-/-小鼠的巨噬细胞,使之形成M1、M2型巨噬细胞后,应用ELISA和Real-time PCR方法检测TGF-β1的表达及分泌。结果显示:ELISA检测发现CD24-/-小鼠的M2型巨噬细胞上清中,TGF-β1的分泌量多于WT的M2型巨噬细胞上清,而在M1型巨噬细胞上清中无明显变化。同样,Real-time PCR检测TGF-β1 m RNA表达得到了同样的结果。结论:CD24分子在肝纤维化小鼠肝组织中表达升高,调节了CCl4所诱导的小鼠肝纤维化,其机制可能是通过调节肝内M2型巨噬细胞所分泌的促纤维化因子TGF-β1,进而改变肝星状细胞(HSCs)的活性以减轻肝的纤维化。