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目的：
通过转人ApoE4基因和铝暴露联合干预，模拟遗传危险因素和环境危险因素联合作用，研究二者对小鼠学习记忆能力的影响，以及神经元形态和突触结构可塑性的影响，分析二者间是否存在交互作用；同时，通过检测Aβ含量，APP、ApoER2、LRP1、VLDLRs基因和蛋白的表达情况，tau磷酸化水平，探讨二者联合作用对认知损伤的可能机制。
方法：
本实验采用3种雄性小鼠，ApoE基因敲除小鼠(KO)、野生型小鼠(WT)和ApoE4人源化小鼠(KI)，分别设对照组和染铝组。染铝组通过腹腔注射给予麦芽酚铝(Al，40μmol/kg，每染毒5天，间歇2天，共60天)，对照组给予同体积的生理盐水(NS)。染毒结束后，采用连接酶检测反应检测ApoE4人源化小鼠是否稳定遗传了ApoE4基因；电感耦合等离子体质谱法测定脑铝含量；Morris水迷宫和新物体识别实验检测动物学习和记忆能力的变化。通过HE染色、Golgi染色以及电镜实验，观察动物海马组织病理学的结构变化、神经元形态结构的变化、树突棘密度的变化、突触结构的变化。通过Elisa法检测Aβ40和Aβ42的含量，通过RT-PCR和Western-blot法检测APP、ApoER2、LRP1、VLDLRs等基因和蛋白的表达情况。同时，用Western-blot法检测tau-5、pThr181、pThr231、pSer262和pSer396蛋白含量。
结果：
1.实验中所使用ApoE4人源化小鼠在rs429358、rs7412对应位点的碱基均为CC/CC，证明小鼠均稳定遗传了人ApoE4基因。脑铝含量检测结果显示，染铝组动物脑铝含量(KO+Al：35.34±5.4μg/g、WT+Al：33.62±4.00μg/g、KI+Al：35.56±8.72μg/g)均明显高于对照组(KO+NS：6.52±2.34μg/g、WT+NS：5.75±1.20μg/g、KI+NS：5.80±1.83μg/g)，差异有统计学意义(P＜0.01)。Morris水迷宫实验结果显示，动物类型和干预措施(是否染铝)对动物逃避潜伏期无交互作用(P＞0.05)，而各自主效应有统计学意义(P＜0.05)，LSD法进行两两比较显示ApoE4、铝均可延长逃避潜伏期；穿越平台位置次数结果(KO+NS：4.63±0.92次、WT+NS：2.75±1.28次、KI+NS：2.38±0.92次；KO+Al：1.75±0.71次、WT+Al：1.50±0.53次、KI+Al：1.25±0.89次)显示，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.05)，各自的单独效应也有统计学意义(P＜0.05)，两两比较结果表明ApoE4、铝可减少动物穿越平台位置次数，并存在交互作用。新物体识别实验结果，T2测试期KI+Al组小鼠探索新物体和已熟悉物体时间相近，无统计学意义(P＞0.05)，其余各组均有统计学意义(P＜0.05)；辨别指数结果(KO+NS：55.1±10.7、WT+NS：46.7±8.7、KI+NS：40.7±5.9；KO+Al：41.9±9.8、WT+Al：26.8±9.4、KI+Al：0.8±16)分析表明，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.01)，各自的单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可降低动物辨别指数，并存在交互作用。
2.HE染色结果显示，各组动物海马神经元细胞大小、形态均正常，未观察到萎缩、凋亡等改变；Golgi染色，KI+Al组动物可观察到有神经元断裂。树突交叉点个数(距胞体20μm处，KO+NS：7.20±0.64、WT+NS：5.44±0.33、KI+NS：5.35±0.31；KO+Al：5.29±0.75、WT+Al：4.60±0.2、KI+Al：4.15±0.28)和树突棘密度(KO+NS：0.72±0.07个/μm、WT+NS：0.57±0.06个/μm、KI+NS：0.39±0.05个/μm；KO+Al：0.53±0.06个/μm、WT+Al：0.34±0.05个/μm、KI+Al：0.26±0.04个/μm)结果分析显示，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.05)，各自的单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可减少树突交叉点个数和树突棘密度，并存在交互作用。电镜实验，突触后致密区(PSD)厚度(KO+NS：41.02±2.31nm、WT+NS：35.17±2.75nm、KI+NS：33.19±3.49nm；KO+Al：31.80±2.01nm、WT+Al：26.07±3.98nm、KI+Al：19.67±2.06nm)和突触界面曲率(KO+NS：26.70±7.95、WT+NS：17.34±1.96、KI+NS：6.40±1.16；KO+Al：8.96±1.54、WT+Al：4.54±1.05、KI+Al：2.57±0.89)结果分析显示，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.05)，各自的单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可降低PSD厚度和突触界面曲率，并存在交互作用。
3.Elisa法检测Aβ含量，动物类型和干预措施对Aβ40含量无交互作用(P＞0.05)，各自主效应也无统计学意义(P＞0.05)，而Aβ42测定结果(KO+NS：7.01±3.75pg/ml、WT+NS：11.06±4.23pg/ml、KI+NS：13.13±6.92pg/ml；KO+Al：14.10±7.69pg/ml、WT+Al：16.29±6.50pg/ml、KI+Al：29.10±15.06pg/ml)显示，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.01)，各自的单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可增加脑内Aβ42含量，并存在交互作用。基因和蛋白测定结果，动物类型和干预措施对APP基因和蛋白表达无交互作用(P＞0.05)，但各自主效应有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可增加APP基因和蛋白的表达；ApoER2基因，动物类型和干预措施无交互作用(P＞0.05)，但各自主效应有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可降低ApoER2基因表达，ApoER2蛋白(KO+NS：1.000±0.000、WT+NS：0.764±0.091、KI+NS：0.516±0.082；KO+Al：0.788±0.074、WT+Al：0.660±0.084、KI+Al：0.284±0.053)，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.05)，各自的单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可降低ApoER2蛋白表达，并存在交互作用；LRP1基因和蛋白，动物类型和干预措施无交互作用(P＞0.05)，但各自主效应有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可降低LRP1基因和蛋白表达；VLDLRs基因和蛋白，动物类型和干预措施无交互作用(P＞0.05)，但各自主效应有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可降低VLDLRs基因和蛋白表达。
4.tau蛋白检测结果：动物类型和干预措施对tau-5蛋白表达(KO+NS：1.000±0.000、WT+NS：1.327±0.098、KI+NS：1.538±0.210；KO+Al：1.405±0.150、WT+Al：1.747±0.305、KI+Al：2.339±0.460)有交互作用(P＜0.05)，各自单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可增加tau-5蛋白的表达，并存在交互作用；pThr181蛋白(KO+NS：1.000±0.000、WT+NS：1.434±0.350、KI+NS：1.905±0.418；KO+Al：1.638±0.292、WT+Al：2.22±0.500、KI+Al：3.438±0.719)，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.01)，各自单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可增加pThr181蛋白的表达，并存在交互作用；pThr231蛋白(KO+NS：1.000±0.000、WT+NS：1.543±0.409、KI+NS：2.215±0.470；KO+Al：1.722±0.338、WT+Al：2.549±0.571、KI+Al：4.176±0.577)，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.01)，各自单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可增加pThr231蛋白的表达，并存在交互作用；pSer262蛋白，动物类型和干预措施无交互作用(P＞0.05)，而动物类型主效应有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4可增加pSer262蛋白表达；pSer396蛋白(KO+NS：1.000±0.000、WT+NS：1.305±0.107、KI+NS：1.564±0.254；KO+Al：1.325±0.192、WT+Al：1.687±0.404、KI+Al：2.423±0.490)，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.05)，各自单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可增加pSer396蛋白的表达，并存在交互作用。
结论：
1.ApoE4单独作用，可引起小鼠脑内Aβ42含量升高，APP基因和蛋白表达升高，ApoER2、LRP1、VLDLRs基因和蛋白表达下降，脑内t-tau和p-tau水平升高，神经元复杂程度和突触结构可塑性降低，最终影响小鼠的学习和记忆能力，本实验进一步证实了ApoE4是AD(Alzheimers disease)的危险遗传因素。
2.亚慢性铝暴露，可引起小鼠脑内铝含量升高，Aβ42含量升高，APP基因和蛋白表达升高，ApoER2、LRP1、VLDLRs基因和蛋白表达下降，脑内t-tau和p-tau水平升高，神经元复杂程度和突触结构可塑性降低，小鼠学习和记忆能力下降，也进一步证实了铝是AD的危险环境因素。
3.通过析因分析，ApoE4和铝联合作用对AD动物的影响主要表现为，升高脑内Aβ42含量，影响神经元的形态结构、复杂程度以及突触的结构可塑性，降低ApoER2蛋白含量，升高t-tau和p-tau水平，增加tau231，tau396位点的磷酸化，降低小鼠的认知功能。
4.本实验首次从动物实验角度，证实了遗传因素(ApoE4)和环境因素(铝)可促进AD的进程发展，其机制可能为，二者联合作用阻断了ApoER2的受体循环，使转录后ApoER2的表达降低，影响Aβ的清除，升高t-tau和p-tau水平，从而损伤神经元的形态结构和突触的结构可塑性，进而影响动物的学习和记忆能力，最终促进AD进程的发展。
通过转人ApoE4基因和铝暴露联合干预，模拟遗传危险因素和环境危险因素联合作用，研究二者对小鼠学习记忆能力的影响，以及神经元形态和突触结构可塑性的影响，分析二者间是否存在交互作用；同时，通过检测Aβ含量，APP、ApoER2、LRP1、VLDLRs基因和蛋白的表达情况，tau磷酸化水平，探讨二者联合作用对认知损伤的可能机制。
方法：
本实验采用3种雄性小鼠，ApoE基因敲除小鼠(KO)、野生型小鼠(WT)和ApoE4人源化小鼠(KI)，分别设对照组和染铝组。染铝组通过腹腔注射给予麦芽酚铝(Al，40μmol/kg，每染毒5天，间歇2天，共60天)，对照组给予同体积的生理盐水(NS)。染毒结束后，采用连接酶检测反应检测ApoE4人源化小鼠是否稳定遗传了ApoE4基因；电感耦合等离子体质谱法测定脑铝含量；Morris水迷宫和新物体识别实验检测动物学习和记忆能力的变化。通过HE染色、Golgi染色以及电镜实验，观察动物海马组织病理学的结构变化、神经元形态结构的变化、树突棘密度的变化、突触结构的变化。通过Elisa法检测Aβ40和Aβ42的含量，通过RT-PCR和Western-blot法检测APP、ApoER2、LRP1、VLDLRs等基因和蛋白的表达情况。同时，用Western-blot法检测tau-5、pThr181、pThr231、pSer262和pSer396蛋白含量。
结果：
1.实验中所使用ApoE4人源化小鼠在rs429358、rs7412对应位点的碱基均为CC/CC，证明小鼠均稳定遗传了人ApoE4基因。脑铝含量检测结果显示，染铝组动物脑铝含量(KO+Al：35.34±5.4μg/g、WT+Al：33.62±4.00μg/g、KI+Al：35.56±8.72μg/g)均明显高于对照组(KO+NS：6.52±2.34μg/g、WT+NS：5.75±1.20μg/g、KI+NS：5.80±1.83μg/g)，差异有统计学意义(P＜0.01)。Morris水迷宫实验结果显示，动物类型和干预措施(是否染铝)对动物逃避潜伏期无交互作用(P＞0.05)，而各自主效应有统计学意义(P＜0.05)，LSD法进行两两比较显示ApoE4、铝均可延长逃避潜伏期；穿越平台位置次数结果(KO+NS：4.63±0.92次、WT+NS：2.75±1.28次、KI+NS：2.38±0.92次；KO+Al：1.75±0.71次、WT+Al：1.50±0.53次、KI+Al：1.25±0.89次)显示，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.05)，各自的单独效应也有统计学意义(P＜0.05)，两两比较结果表明ApoE4、铝可减少动物穿越平台位置次数，并存在交互作用。新物体识别实验结果，T2测试期KI+Al组小鼠探索新物体和已熟悉物体时间相近，无统计学意义(P＞0.05)，其余各组均有统计学意义(P＜0.05)；辨别指数结果(KO+NS：55.1±10.7、WT+NS：46.7±8.7、KI+NS：40.7±5.9；KO+Al：41.9±9.8、WT+Al：26.8±9.4、KI+Al：0.8±16)分析表明，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.01)，各自的单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可降低动物辨别指数，并存在交互作用。
2.HE染色结果显示，各组动物海马神经元细胞大小、形态均正常，未观察到萎缩、凋亡等改变；Golgi染色，KI+Al组动物可观察到有神经元断裂。树突交叉点个数(距胞体20μm处，KO+NS：7.20±0.64、WT+NS：5.44±0.33、KI+NS：5.35±0.31；KO+Al：5.29±0.75、WT+Al：4.60±0.2、KI+Al：4.15±0.28)和树突棘密度(KO+NS：0.72±0.07个/μm、WT+NS：0.57±0.06个/μm、KI+NS：0.39±0.05个/μm；KO+Al：0.53±0.06个/μm、WT+Al：0.34±0.05个/μm、KI+Al：0.26±0.04个/μm)结果分析显示，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.05)，各自的单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可减少树突交叉点个数和树突棘密度，并存在交互作用。电镜实验，突触后致密区(PSD)厚度(KO+NS：41.02±2.31nm、WT+NS：35.17±2.75nm、KI+NS：33.19±3.49nm；KO+Al：31.80±2.01nm、WT+Al：26.07±3.98nm、KI+Al：19.67±2.06nm)和突触界面曲率(KO+NS：26.70±7.95、WT+NS：17.34±1.96、KI+NS：6.40±1.16；KO+Al：8.96±1.54、WT+Al：4.54±1.05、KI+Al：2.57±0.89)结果分析显示，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.05)，各自的单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可降低PSD厚度和突触界面曲率，并存在交互作用。
3.Elisa法检测Aβ含量，动物类型和干预措施对Aβ40含量无交互作用(P＞0.05)，各自主效应也无统计学意义(P＞0.05)，而Aβ42测定结果(KO+NS：7.01±3.75pg/ml、WT+NS：11.06±4.23pg/ml、KI+NS：13.13±6.92pg/ml；KO+Al：14.10±7.69pg/ml、WT+Al：16.29±6.50pg/ml、KI+Al：29.10±15.06pg/ml)显示，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.01)，各自的单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可增加脑内Aβ42含量，并存在交互作用。基因和蛋白测定结果，动物类型和干预措施对APP基因和蛋白表达无交互作用(P＞0.05)，但各自主效应有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可增加APP基因和蛋白的表达；ApoER2基因，动物类型和干预措施无交互作用(P＞0.05)，但各自主效应有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可降低ApoER2基因表达，ApoER2蛋白(KO+NS：1.000±0.000、WT+NS：0.764±0.091、KI+NS：0.516±0.082；KO+Al：0.788±0.074、WT+Al：0.660±0.084、KI+Al：0.284±0.053)，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.05)，各自的单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可降低ApoER2蛋白表达，并存在交互作用；LRP1基因和蛋白，动物类型和干预措施无交互作用(P＞0.05)，但各自主效应有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可降低LRP1基因和蛋白表达；VLDLRs基因和蛋白，动物类型和干预措施无交互作用(P＞0.05)，但各自主效应有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可降低VLDLRs基因和蛋白表达。
4.tau蛋白检测结果：动物类型和干预措施对tau-5蛋白表达(KO+NS：1.000±0.000、WT+NS：1.327±0.098、KI+NS：1.538±0.210；KO+Al：1.405±0.150、WT+Al：1.747±0.305、KI+Al：2.339±0.460)有交互作用(P＜0.05)，各自单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可增加tau-5蛋白的表达，并存在交互作用；pThr181蛋白(KO+NS：1.000±0.000、WT+NS：1.434±0.350、KI+NS：1.905±0.418；KO+Al：1.638±0.292、WT+Al：2.22±0.500、KI+Al：3.438±0.719)，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.01)，各自单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可增加pThr181蛋白的表达，并存在交互作用；pThr231蛋白(KO+NS：1.000±0.000、WT+NS：1.543±0.409、KI+NS：2.215±0.470；KO+Al：1.722±0.338、WT+Al：2.549±0.571、KI+Al：4.176±0.577)，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.01)，各自单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可增加pThr231蛋白的表达，并存在交互作用；pSer262蛋白，动物类型和干预措施无交互作用(P＞0.05)，而动物类型主效应有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4可增加pSer262蛋白表达；pSer396蛋白(KO+NS：1.000±0.000、WT+NS：1.305±0.107、KI+NS：1.564±0.254；KO+Al：1.325±0.192、WT+Al：1.687±0.404、KI+Al：2.423±0.490)，动物类型和干预措施有交互作用(P＜0.05)，各自单独效应也有统计学意义(P＜0.01)，两两比较结果表明ApoE4、铝可增加pSer396蛋白的表达，并存在交互作用。
结论：
1.ApoE4单独作用，可引起小鼠脑内Aβ42含量升高，APP基因和蛋白表达升高，ApoER2、LRP1、VLDLRs基因和蛋白表达下降，脑内t-tau和p-tau水平升高，神经元复杂程度和突触结构可塑性降低，最终影响小鼠的学习和记忆能力，本实验进一步证实了ApoE4是AD(Alzheimers disease)的危险遗传因素。
2.亚慢性铝暴露，可引起小鼠脑内铝含量升高，Aβ42含量升高，APP基因和蛋白表达升高，ApoER2、LRP1、VLDLRs基因和蛋白表达下降，脑内t-tau和p-tau水平升高，神经元复杂程度和突触结构可塑性降低，小鼠学习和记忆能力下降，也进一步证实了铝是AD的危险环境因素。
3.通过析因分析，ApoE4和铝联合作用对AD动物的影响主要表现为，升高脑内Aβ42含量，影响神经元的形态结构、复杂程度以及突触的结构可塑性，降低ApoER2蛋白含量，升高t-tau和p-tau水平，增加tau231，tau396位点的磷酸化，降低小鼠的认知功能。
4.本实验首次从动物实验角度，证实了遗传因素(ApoE4)和环境因素(铝)可促进AD的进程发展，其机制可能为，二者联合作用阻断了ApoER2的受体循环，使转录后ApoER2的表达降低，影响Aβ的清除，升高t-tau和p-tau水平，从而损伤神经元的形态结构和突触的结构可塑性，进而影响动物的学习和记忆能力，最终促进AD进程的发展。