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研究目的：肿瘤干细胞是肿瘤组织中数量极少具有干细胞特性的细胞,既表现出干细胞的特性又有肿瘤细胞的特点,是肿瘤耐药、复发和转移的根源。有研究证明CD44high表型的肺癌细胞比CD44low表型的肺癌细胞有更强的成球能力和致瘤性,接种300个CD44high细胞于NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠就可以形成肿瘤,而接种3×104个CD44low细胞或5×105个未分离的混合细胞都不能形成肿瘤。LIN28是一种首先在线虫C. elegants中发现的RNA结合蛋白,在其发育过程中起重要作用；在哺乳动物中LIN28具有结构和功能高度同源的两种同系物LIN28A和LIN28B [2]。已有研究表明LIN28在多种肿瘤中高表达,与肿瘤的发生、转移密切相关。microRNA是一类长度为21～25个核苷酸的非编码RNA,通过与靶基因mRNA的3’-UTR结合对其进行转录后调控。有研究发现LIN28通过阻止Let-7的加工成熟,影响靶基因的表达从而对调节细胞代谢和干性发挥重要作用。已有的研究主要是集中在LIN28通过抑制Let-7的加工成熟发挥调控作用,不过LIN28也能调控其他miRNAs如miR-150。本研究的主要目的是探究LIN28B对乳腺癌干细胞干性特征的调控并通过miRNA测序发现其他受LIN28B调控的miRNAs并进一步研究miRNA对MCF-7肿瘤干细胞的作用。研究方法：首先检测恶性程度高的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞和低转移性MCF-7乳腺癌细胞干性相关基因SOX2、OCT4、NANOG和LIN28B的mRNA和蛋白表达,确定LIN28B在恶性程度不同的乳腺癌细胞中的表达水平。然后在MCF-7细胞转染p-CMV6-LIN28B质粒瞬时过表达LIN28B,通过RNA测序找出差异表达的miRNAs,并进一步通过病毒感染方法在MCF-7细胞建立稳定过表达LIN28B细胞系,检测干性相关基因mRNA和蛋白的表达、利用流式细胞仪检测CD44highCD24low细胞比例和通过成球培养比较体外成球能力。最后在MCF-7细胞转染该差异表达的miRNA mimic,检测CD44highCD24low细胞比例和比较体外成球能力。研究结果：1. LIN28B在恶性程度高的MDA-MB-231细胞表达显著增高。2. LIN28B能明显上调MCF-7细胞SOX2、OCT4和NANOG的表达。3. LIN28B能上调MCF-7细胞中CD44highCD24low细胞比例和促进MCF-7细胞的体外成球能力。4.MCF-7细胞过表达LIN28B后miR-92b-5p表达上调,miR-4521、miR-149-3p和miR-92a-1-5p表达下调。5.MCF-7细胞转染miR-92b-5p mimic后CD44highCD24low细胞比例增高并且体外成球能力增强。结论：通过调控miR-92b-5p的表达是LIN28B促进乳腺癌MCF-7细胞干性特征的机制之一。研究目的:葡萄糖是细胞最主要的能量来源,正常细胞摄取葡萄糖后,在氧气充足的条件下,通过H綾酸循环将葡萄糖彻底氧化成C〇2和H20,仅在低氧条件下,细胞进行糖酵解生成乳酸。但与正常细胞不同的是,肿瘤细胞不管是在氧气充足还是低氧条件都W糖酵解的方式提供能量,这就是著名的"Warburg effect"。2012年Hanahan和Weinberg将细胞能量代谢异常总结为肿瘤的十大特征之一近年来肿瘤细胞的这种特殊的代谢方式重新受到广泛关注,其形成的机制及对肿瘤的发生、发展等影响也成为研巧的热点。但是目前关于肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)的代谢状态还不是很清楚,CSCs可W根据不同的条件对自身的代谢状态进行调整,适应环境的变化。己有研究wwsi发现静息的造血干细胞的代谢状态对其自我更新有重要的调节作用,有研究指出糖酵解对维持CSCs的干性至关重要twi,Vermeersch等CW通过对普通卵巢癌细胞和卵巢癌干细胞进行质谱分析发现,这两类细胞的代谢表型不同,卵巢癌干细胞对葡萄糖的依赖程度高于普通卵巢癌细胞。本课题主要研究人乳腺癌干细胞的糖代谢状态&及LIN28B在该代谢过程中的调控机制和糖代谢方式与维持孔腺癌干细胞的干性特征么间的关系,为了解肿瘤干细胞及肿瘤治疗提供新思路。研究方法:首先我们利用体外成球培养的方法富集MDA-MB-231细胞的肿瘤干细胞并用孔径70^im细胞筛过滤细胞球;然后用细胞能量代谢分析仪检测细胞球和贴壁细胞中线粒体呼吸功能和糖酵解功能,用western blot检测糖酵解关键分子PKM2、LDHA和曲F-la的蛋白表达。然后使用实验室已建立的病毒感染方法沉默LIN28B基因的稳定MDA-MB-231细胞系,用细胞能量代谢分析仪比较对照组和shLIN2犯组细胞的线粒体呼吸功能和糖酵解功能;用TALEN技术敲除MDA-MB-231细胞的LIN28B基因,用流式细胞仅检测野生型细胞和LIN28B敲除细胞对2-NBDG的摄取并比较这两组细胞对葡萄糖的摄取。最后用LDHA活性检测试剂盒检测细胞球和贴壁细胞的LDHA活性;在MDA-MB-231细胞和H1299细胞加入LDHA抑制剂oxamate,用CCK8试剂检测不同浓度oxamate对细胞活性的影响,通过体外成球培养比较不同浓度oxamate对MDA-MB-231细胞的体外成球能力。研究结果:1.現腺癌干细胞的有氧糖醇解增强而线粒体的氧化磯酸化被抑制且高表达糖酵解关键分子PKM2、LDHA和HIF-la。2.LIN28B能促进MDA-MB-231细胞表达糖酵解关键分子PKM2、LDHA和出F-la,使MDA-MB-231细胞摄取葡萄糖增多。3.LIN28B促进MDA-MB-231细胞糖酵解并且抑制线粒体的氧化磯酸化。4.LIN28B能与LDHA和扭F-la的mRNA直接结合5.孰腺癌干细胞LDHA活性增高,通过oxamate抑制LDHA活性阻断糖酵解途径后能降低MDA-MB-231细胞的体外成球能力。结论;乳腺癌干细胞的糖代谢方式主要为有氧糖酵解并且抑制有氧糖酵解途径可抑制其干性特征;LIN28B通过直接与mRNA结合上调LDHA和HIF-la表达并促进MDA-MB-231细胞的有氧糖酵解。