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产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)可引起仔猪腹泻,严重时甚至导致死亡,给养猪业带来严重的经济损失。热稳定性肠毒素STa(heat-stable enterotoxin)是ETEC的关键毒力因子,将STa去毒后制成亚单位疫苗,该疫苗具有良好效果。但亚单位疫苗需要通过注射免疫,并且需要低温保藏和运输,这不但使疫苗成本高也给使用带来不便。因此,研制出能口服免疫并且常温保藏和运输的疫苗是解决该问题的良好方略。蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)MIL158菌株具有益生菌的特性,可用作微生态制剂,动物口服安全,其芽胞体耐热,可常温保藏。S-层蛋白是可将外源蛋白展示到微生物细胞表面的良好载体。本研究利用S-层蛋白的表面展示功能和蜡样芽胞杆菌芽胞的热稳定性能,构建了表达ETEC STa类毒素的蜡样芽胞杆菌重组菌株,测定了重组菌株对小鼠的免疫原性,从而为研制安全且能常温运输和保藏的STa疫苗初步打下了基础。1.插入法重组菌株的构建及其对小鼠免疫原性的测定Overlap PCR合成STa类毒素基因msta(mutant sta),插入载体p BMB982-304中S-层蛋白基因ctc锚定序列slh(S-layer homology)后面的Xba I位点,在ctc前面插入细胞壁锚定所必需的csa AB操纵元,获得重组质粒p CSA-S(csa-ctc-msta)。电转化重组质粒入受体菌株MIL158,获得重组菌株MIL158/p CSA-S。Western blotting检测重组菌株表达了含STa的融合蛋白。用重组菌株免疫小鼠,用ELISA测定小鼠血清抗体OD450值,结果,重组菌株的检测值显著高于(P<0.05)三个对照组(PBS组、MIL158无质粒组和MIL158/p BMB982-304空质粒组)。结果表明,重组菌株MIL158/p CSA-S免疫小鼠产生了STa抗体。2.替换法重组菌株的构建及其对小鼠免疫原性的测定为了考察不同的融合基因构建方式对小鼠免疫原性的影响,本研究又用替换法构建了重组菌株。Overlap PCR扩增mgfp-linker-msta、ctc-his-msta和ctc-msta-his基因,替换载体p BMB982-304中S-层蛋白ctc基因中部Xba I和Hinc II之间的序列,在ctc前插入细胞壁锚定所必需的操纵元csa AB,获得重组质粒p CSA-GS(csa-ctc-mgfp-linker-msta)、p CSA-HS(csa-ctc-his-msta)和p CSA-SH(csa-ctc-msta-his)。电转化重组质粒入MIL158,获得三个重组菌株MIL158/p CSA-GS、MIL158/p CSA-HS和MIL158/p CSA-SH。用重组菌株免疫小鼠,用ELISA测定小鼠血清抗体OD450值,结果,三个重组菌株的检测值均显著高于对照组(P<0.05)。结果表明,三个重组菌株免疫小鼠均产生了STa抗体。与插入法构建方式相比,替换法重组菌株免疫后的OD450值显著高于插入法(P<0.05)。