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背景:胆管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是较为少见的恶性肿瘤,约占全部消化道肿瘤的3%,是目前第二大原发性肝胆系恶性肿瘤,仅次于肝细胞癌。CCA的发病率一直在上升,但5年生存率不超过10%。其预后极差,平均生存期小于24个月。CCA起病隐匿,早期诊断困难,对化疗及放疗均不敏感,目前认为手术切除是最有效的治疗方法,但是,早期症状、体征隐匿,诊断方法局限,缺乏有效的手段,且由于胆管位置特殊,CCA容易侵犯邻近组织、血管呈浸润性生长等特性,确诊为CCA的患者中有根治性手术的机会的仅有不到30%。因此,进一步研究CCA的发病机制,探明机制间的相关联系,并寻求有效的治疗方法,是提高CCA的疗效及预后的重要措施,具有深远意义。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)又称离散因子,对机体的作用分为两方面。一方面,即在正常生理条件下,HGF促进正常细胞的生长和再生,对机体是有利的;另一方面,在肿瘤组织中,即在病理生理条件下,HGF将促进肿瘤细胞异常增生,促进肿瘤本身及周围微血管的过度生成,导致肿瘤对周围组织的侵袭及发生远处转移。HGF是通过受体c-Met发生作用的,HGF/c-Met途径在最近几年是肿瘤发病机制的信号通路中的研究热点,研究发现,HGF/c-Met途径失调参与多种肿瘤的的发生、发展、侵袭和转移。NK4是第一个被证实的HGF/c-Met信号通路拮抗剂,它与HGF的α链结构相似,可以与受体c-Met结合,完全地竞争性抑制HGF与受体c-Met的结合,导致c-Met无法磷酸化,因而影响HGF/c-Met系统的信号转导,最终抑制HGF/c-Met信号通路诱导的细胞增殖和侵袭。另外,NK4可以通过抑制血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,从而抑制微血管的生成。缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-lα,HIF-lα)是调控VEGF的重要转录因子,它通过结合并激活内皮细胞表面的酪氨酸激酶受体,诱导内皮细胞增生、迁移以及细胞间质蛋白水解等,从而参与血管的生成。目的:本研究分别从体外实验和动物模型两个方面,探讨NK4基因对HIF-1α/VEGF通路介导的CCA微血管生成和侵袭的影响。方法:1.NK4(Hu-NK4)和对照质粒(Hu-Em)稳转的人胆管癌HuCC-T1细胞株在常氧或缺氧条件下用HGF处理,分别通过MTT、Transwell侵袭试验和流式细胞术分析CCA细胞的增殖、侵袭和凋亡;2.用HuCC-T1/Em和HuCC-T1/NK4稳转细胞株建立裸鼠CCA皮下移植瘤模型,通过测量瘤体的大小和重量分析异种移植小鼠模型中人CCA的肿瘤生长,通过免疫组化测定CD31阳性微血管分析肿瘤血管的生成,通过Real-time-PCR 和 Western-blotting 分析缺氧诱导因子 1-α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)和CD31的表达。结果:1.在常氧和缺氧条件下,过表达NK4显著抑制HuCC-T1细胞的增殖;并且,在缺氧条件下,NK4对HuCC-T1细胞增殖的抑制作用显著增强;2.在常氧和缺氧条件下,过表达NK4显著促进HuCC-T1细胞凋亡;并且,在缺氧条件下,NK4诱导的HuCC-T1细胞凋亡显著增强;3.过表达NK4使HuCC-T1细胞侵袭力减弱,并可抑制缺氧的促侵袭作用;4.缺氧可上调HuCC-T1细胞中的HIF-1α,CD31和VEGF基因的表达,过表达NK4下调HIF-1α、CD31和VEGF表达,抑制缺氧的促微血管生成作用;5.在HuCC-T1细胞移植小鼠模型中,过表达NK4抑制瘤体生长;6.过表达NK4下调CCA肿瘤组织中HIF-1α、CD31和VEGF基因的表达,抑制肿瘤微血管的生成。结论:1.HGF拮抗剂NK4在体外显著抑制胆管癌HuCC-T1细胞的增殖和侵袭,并诱导HuCC-T1细胞凋亡;2.NK4抑制HuCC-T1细胞HIF-1α、VEGF和CD31等因子的表达,并显著抑制缺氧诱导的促肿瘤微血管的生成;3.在胆管癌小鼠模型中,NK4通过抑制肿瘤组织HIF-1α、VEGF和CD31等因子的表达,显著抑制肿瘤的生长和微血管形成。