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目的人类皮肤的颜色主要靠表皮中黑素细胞(MC)合成黑素以及黑素传递至周围角质形成细胞(KC)来维持。如果黑素细胞合成和传递黑素的功能出现异常,就会导致各种皮肤色素性疾病(如:白癜风、黄褐斑等)的发生。因此研究影响黑素细胞合成和传递黑素的因素及其机制,对于预防和治疗色素性皮肤病具有十分重要的临床意义。皮肤暴露于日光下可引起皮肤晒黑,既往的研究认为这些改变主要与紫外线(ultraviolet,UV),尤其是中波紫外线(ultraviolet B,UVB)有关。但近来,越来越多的证据表明日光中主要的能量物质—热(红外线)对皮肤具有类似UV的作用,同时热(红外线)还可增加皮肤细胞对UV的耐受性。上个世纪末,Nakazawa等[1]首先比较了人表皮MC对两种外源性刺激UVB和热的细胞反应,结果发现:热(42℃,60min)和UVB(20mJ/cm~2)辐射处理纯化培养的人表皮MC3d后,MC树突增多延长、包体增大,细胞的酪氨酸酶活性和黑素合成增加、增值率下降。同时还发现热和UVB均能促进KC-MC共培养体系和组织工程皮肤中有功能的活性MC数量增加,所以作者认为热与UVB具有类似的MC生理调节作用。但后来Kim等[2,3]人报道了一个相反的结果,他们发现热以温度依赖方式分别减少了小鼠MC系Mel-Ab和人表皮MC的黑素合成。为了进一步明确热对黑素细胞生理功能的调节作用,本实验利用体外培养正常人表皮黑素细胞研究了热应激对黑素细胞的增殖活性、细胞形态、黑素合成及酪氨酸酶活性的影响,并初步从蛋白层面上探讨了热休克蛋白72(HSP72)和p53在热应激引起黑素细胞功能变化中的作用。方法1.无菌操作获取正常人包皮环切术后的包皮,按照皮肤表皮细胞培养法获取黑素细胞;利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)为主要有丝分裂原建立正常人表皮黑素细胞培养系,采用Masson-Fontana染色法对培养细胞进行鉴定,确定细胞种系。2.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定不同温度(39℃、41℃、42℃、43℃、45℃)的热应激对黑素细胞活力的影响并选择最佳的温度剂量作为实验条件进行后续实验。3.比较正常温度(37℃)与最佳实验温度热应激下的黑素细胞形态、酪氨酸酶活性和黑素含量的变化;并利用Western-bloting和RT-PCR技术比较正常温度和热应激条件下黑素细胞中HSP72和p53的蛋白和基因表达水平的变化。4.所获得的数据结果经SPSS13.0统计软件进行分析。结果1.黑素细胞在热应激干预后细胞形态较干预前胞体增大,树突明显增多、变短呈多极化,树突上明显可见树枝状分叉,电子显微镜显示:实验组细胞胞浆中黑素小体数量较对照组有所增加,黑素小体中黑素更加致密。实验组与对照组细胞的超微结构均较完整,未见明显的细胞器破坏。2.体外培养的正常人黑素细胞(MC)在42℃每天干预1h,连续干预3d的热应激条件下,细胞的黑素合成量为0.152±0.005 ,较正常对照组(0.086±0.005)有明显增加,增长率为78%(t=24.81,P<0.01);相同条件下实验组细胞的酪氨酸酶活性为0.193±0.004,较正常对照组(0.142±0.011)亦有明显增加,增长率为36.4%(t=9.34,P<0.01)。3.体外培养的正常人黑素细胞(MC)在42℃每天干预1h,连续干预3d的热应激条件下,细胞在末次干预后6h、12h和24h的HSP72和p53的蛋白表达均高于对照组,末次干预后12小时的HSP72和p53的基因表达也均高于对照组。结论本次实验结果显示:42℃的热应激条件下,体外培养的正常人MC的细胞状态明显好于正常对照组,并且其细胞的各项生物学活性较正常对照组亦明显增强,这表明热应激对体外培养的正常人MC生物功能起着一定的正向调节作用。HSP72和p53蛋白在热应激状态下表达较正常对照组升高,提示我们这两种蛋白分子可能在热应激引起MC生物活性增强的过程中起着重要的调控作用。这为进一步研究热应激调节人表皮MC生长和黑素合成的作用机制提供了重要的理论依据,并为色素性皮肤病的预防和治疗开辟了一条新的思路。