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第一部分:结直肠癌组织中DDX46的表达及临床意义目的通过DDX46在结直肠癌(CRC)组织和癌旁组织的表达差异研究,探讨DDX46表达水平与结直肠癌临床病理及预后的相关性。方法(1)运用免疫组织化学法,检测149例结直肠癌组织样本、45例癌旁组织样本中DDX46蛋白表达水平;(2)观察DDX46蛋白表达水平与结直肠癌患者年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤浸润、淋巴结转移、TNM分期的相关性。(3)运用免疫组织化学法,测定149例结直肠癌组织样本中DDX46蛋白表达水平与C-erbB-2、KI-67、P53和nm23蛋白表达及预后的相关性。结果149例结直肠癌组织样本中,50例(33.6%)具有低DDX46表达,99例(66.4%)具有高DDX46表达;45例癌旁组织样本中,37例(82.2%)样本DDX46低表达,8例(18.8%)样本DDX46高表达,癌组织与癌旁组织DDX46表达具有显著性差异(P<0.05),癌组织DDX46表达明显高于癌旁组织。29例粘液腺癌组织样本中22例(75.8%)DDX46低表达,而114例管状腺癌样本中24例(21.1%)DDX46低表达,二者具有显著性差异(P<0.01),管状腺癌DDX46表达水平高。DDX46蛋白的表达水平与肿瘤的分化程度(P<0.01)和浸润程度(P<0.01)、淋巴结转转移(P<0.05)具有显著性差异,与TNM分期(P<0.05)具有显著性差异,分化程度越低、浸润程度越高、有淋巴结转移、TNM分期越晚,DDX46表达水平越高。DDX46蛋白不同表达水平与P53、KI-67、nm23存在显著性差异(P<0.05),其中与P53、KI-67为正相关,与nm23存在负相关。99例结直肠癌中,72例DDX高表达病人4年生存率为67.7%,中位生存期32.2月,与27例低表达患者存在显著性差异(4-YSR=79.4%,MST>42.7months;P<0.001)。结论 DDX46 在结直肠癌组织中高表达,DDX46的细胞定位主要集中在癌组织上皮细胞的细胞核中,DDX46表达与Ki-67、p53正相关,与nm23负相关;分化程度越低、TNM分期越晚,DDX46表达越高,而与年龄、性别、部位无关;DDX46表达越低,生存期越长。DDX46可作为结直肠癌患者潜在的诊断、预后标志物。第二部分:DDX46在结直肠癌细胞中的生物学功能研究目的探讨DDX46在结直肠癌细胞中的生物学功能。方法建立慢病毒DDX46-RNAi-LV沉默的RKO和SW480细胞,通过实时定量PCR和Western blot法验证转染效果;通过MTT与克隆形成实验检测DDX46沉默对结直肠癌细胞生长增殖的影响;运用MTT法检测DDX46沉默对结直肠癌细胞存活率的影响;通过Western blot法检测蛋白表达水平;通过流式细胞术进行细胞周期分析;采用免疫组织化学技术观察DDX46在结直肠癌组织细胞的分布。结果与对照组相比,DDX46 mRNA水平在RKO和SW480细胞慢病毒转染后分别减少了 77.0%(P<0.05)和 83%(P<0.05),DDX46 蛋白水平在 DDX46--RNAi-LV 沉默的RKO和SW480细胞中表达也显著降低;连续5天在荧光显微镜下动态监测GFP标记的细胞生长,DDX46-RNAi-LV组GFP标记的细胞数较对照-LV组明显降低;DDX46-RNAi-LV转染的RKO和SW480细胞活力以时间依赖性的方式表现抑制,实验第5天,抑制水平在RKO和SW480细胞中分别高达(27.1 ±3.1)%和(44.0土11.1)%(P<0.05)；与相应的对照-LV组相比,DDX46-RNAi-LV转染的RKO和SW480细胞中克隆数分别降低至61%和80%(P<0.05);DDX46-RNAi-LV转染的RKO细胞的平均凋亡率为9.14%,与对照-LV组的6.12%相比显著增高(P<0.05),同样DDX46-RNAi-LV转染SW480细胞具有较高的凋亡率;Western blot结果显示在DDX46-RNAi-LV转染的SW480细胞中凋亡标记物活化的caspase-3和PARP-1增加;DDX46-RNAi-LV转染的RKO和SW480细胞在GO/G1期的数目略有增加。结论DDX46表达沉默可明显抑制结直肠癌细胞生长、集落形成,细胞周期阻滞在C0/GI期;DDX46表达沉默明显诱导CRC细胞凋亡,可能通过增加活化caspase-3和PARP-1导致。第三部分:DDX46对结直肠癌细胞电离辐射敏感性的影响研究目的探讨DDX46在结直肠癌细胞中的电离辐射敏感性及其机制。方法DDX46-RNAi-LV慢病毒转染SW480细胞或Control-LV,72 h后对转染的细胞分别进行0、4GyX射线照射,CCK8方法检测照后0、24 h时的细胞活力;DDX46-RNAi-LV转染的SW480细胞,4 Gy X射线照射24 h后,检测细胞γ-H2AX foci数量以及DNA损伤修复通路关键蛋白的表达水平,确定DDX46与辐射诱导的DNA损伤修复的关系。结果DDX46-RNAi-LV联合4GyX射线照射组于照射24h 后的细胞活力比 DDX46-RNAi-LV 组降低(17.2±3.7)%、比 Control-LV 联合4GyX射线照射组降低(26.3土1.2)%,而Control-LV联合4GyX射线照射组与Control-LV组间无显著性差异;4 GyX线照射后24 h,DDX46-RNAi-LV组SW480 细胞内的γ-H2AX foci 数量相比于 Control-LV 组增加了(43.03±17.6)%;Western blot的结果显示,4GyX线照射24 h后,相比于Control-LV组,DDX46-RNAi-LV组SW480细胞内ATM的蛋白水平显著升高,而ATM的活性形式p-ATM以及ATM的下游靶蛋白Rad50的蛋白水平则明显降低,同时γ-H2AX的蛋白表达水平也有一定程度的升高;DNA-PK在两组细胞内的蛋白水平变化不大。结论沉默DDX46可以提高结肠癌细胞系SW480的辐射敏感性,其机制可能是DDX46表达沉默抑制结肠癌细胞系SW480中ATM的活化,从而抑制辐射诱导的DNA损伤的修复,提高SW480的辐射敏感性。