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益生菌因为其益生特性有很大的商业价值，在国外益生菌已经得到了广泛的应用。当足够的活菌数被宿主摄入以后将有利于动物机体的健康，如防氧化、助免疫、防感染等。然而在产品的加工、贮藏和使用过程中受环境条件如热、酸、氧等因素影响，导致益生菌活菌数下降而成为限制其应用的一个瓶颈，尤其乳酸菌耐热性能差而限制了其应用前景。本实验室在大量分离乳酸菌样本研究中，自主分离了一株猪源耐热益生乳酸菌—屎肠球菌，为了研究其耐热机制，本研究首次构建了该菌的分子缺失平台，并通过同源重组的方法敲除热休克蛋白Dank基因以探索热休克蛋白Dnak对其耐热的影响。本实验取得的结果如下:
1.革兰氏阳性菌缺失株的构建:屎肠球菌HDRsEf1对氨苄青霉素表现敏感，利用定向克隆技术，将β-内酰胺酶编码序列（CDS序列）置换pSET4S载体中壮观霉素乙酰转移酶编码序列（CDS序列），首次成功构建含有β-内酰胺酶的温敏自杀性载体，命名为pSET7S。扩增热休克蛋白Dnak基因，连接pMD18-T载体，测序、BLAST比对分析找出其同源臂序列，重叠PCR扩增左右同源臂连接屎肠球菌自杀性质粒pSET7S，重组质粒命名为pSET7S-LR。通过菌液PCR、基因测序和Southern Blot验证，成功获得缺失Dnak基因的屎肠球菌;
2.猪源屎肠球菌耐热性质的研究:(1)生长曲线的测定结果表明，屎肠球菌Dnak缺失株的生长特性与野生株相似;(2)屎肠球菌缺失株和野生株分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃培养15分钟，细菌计数结果表明:40℃、45℃无显著性差异，50℃、55℃、65℃缺失株活菌数少于野生株，差别有统计学意义，p小于0.05，60℃、70℃缺失株活菌数少于野生株，差别有统计学意义，p小于0.0.1;(3)屎肠球菌野生株和缺失株分别在40℃、60℃、70℃热应激1小时，每隔10分钟取样进行细菌计数，结果表明:60℃20min、30min、40min缺失株活菌数少于野生株，差别有统计学意义，p小于0.01，70℃10min、20min缺失株和野生株差别有统计学意义，p小于0.01;(4)屎肠球菌野生株和缺失株分别接种于含0％、0.15％、0.3％、0.5％胆盐MRS培养基中37℃培养12小时后，MRS平板计数结果表明:胆盐浓度0.15％、0.3％、0.5％缺失株活菌数少于野生株，差别有统计学意义，p小于0.01;(5)屎肠球菌野生株和缺失株分别接种子pH2.0的盐酸溶液中，37℃培养0h，0.5h，1h，1.5h，2h后取培养液稀释至合适倍数，MRS平板计数结果表明:pH2.0盐酸处理1.5h缺失株活菌数少于野生株，差别有统计学意义，p小于0.01，pH2.0盐酸处理2h缺失株和野生株差别有统计学意义，p小于0.05;(6)对屎肠球菌野生株和缺失株进行抗生素敏感性测试，结果表明野生株和缺失株的抗生素敏感性一致。