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新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）较经典的鸭呼肠孤病毒（Duck reovirus,DRV）宿主谱范围更广,目前没有用于预防和治疗该病毒病的生物制品,因此给疾病预防和控制带来了很大的困难。金丝桃素（Hypericin,HY）是贯叶金丝桃中提取的一种中药单体,具有广谱的抗病毒活性,包括各种逆转录病毒,但因其水溶性较差和细胞毒性等特点限制了它的应用。随着纳米技术的发展壮大,氧化石墨烯（Graphene oxide,GO）被不断的运用到生物医学领域。GO因其独特的结构而具有较高载药能力,并已成为生物医学应用中最具有前景的生物材料。本研究通过GO装载HY,降低了HY对DF-1细胞的细胞毒性,对其复合物进行表征及装载效率的测评,并研究该复合物对新型鸭呼肠孤病毒NDRV-TH11株体内及体外的抗病毒作用效果,为抗鸭呼肠孤病毒药物的开发奠定基础。本研究分为以下几个部分:1氧化石墨烯对金丝桃素的装载、表征及细胞毒性研究采用共混法制备氧化石墨烯/金丝桃素复合物（GO/HY）,计算其装载效率为72.5%;用原子力显微镜（AFM）观察其片层形貌,通过片层厚度分析可知,金丝桃素有效的负载在氧化石墨烯上。通过MTT法检测其细胞毒性,结果如下:当GO浓度达到100?g/mL时,其细胞存活率高达93.16%;与单独的HY相比,经GO负载的HY对DF-1细胞的毒性更低,当HY浓度达到72.5?g/mL时,细胞存活率为91.3%,而GO/HY作用下DF-1细胞存活率高达93.83%。2氧化石墨烯/金丝桃素复合物（GO/HY）体外抗NDRV活性研究以新型鸭呼肠孤病毒TH11株为研究对象,用CPE、滴度法检测GO/HY体外抗NDRV活性。结果如下:通过CPE法观察GO/HY对DNRV引起的DF-1细胞损伤的抑制作用。结果发现,当GO/HY浓度为72.5?g/mL时,细胞病变完全被抑制。用不同浓度的GO/HY处理NDRV感染的DF-1细胞,发现与病毒对照组相比,GO/HY处理组病毒TCID50随着GO/HY浓度的增加而降低。由以上结果可知,GO/HY具有良好的体外抗NDRV活性。3 GO/HY对NDRV体外复制的影响通过测定病毒生长曲线、噬斑减少试验、蛋白质免疫印迹（WB）和间接免疫荧光（IFA）等方法观察GO/HY对体外NDRV复制的影响。结果如下:测定病毒组与GO/HY治疗组（72.5?g/mL）病毒的生长曲线,结果发现病毒对照组接毒48 h后其病毒滴度可达到107.8,治疗组接毒48 h病毒滴度只能达到104.2,说明金丝桃素能明显抑制NDRV在DF-1中的扩增。噬斑试验结果发现各剂量GO/HY治疗组空斑数目明显少于病毒对照组,阴性对照无空斑出现,说明GO/HY可显著抑制DNRV的毒力。通过Western blot检测?C蛋白蛋白表达情况,结果发现当GO/HY浓度为18.125?g/mL时,与病毒对照组一样在35kDa处出现特异性条带,但条带大小明显减弱,中浓度和高浓度GO/HY治疗组无目的条带出现。IFA结果分析显示,病毒组可见明显的绿色荧光,而GO/HY治疗组（72.5?g/mL）的绿色荧光强度则明显减弱。由以上结果可知,GO/HY可显著抑制DNRV的体外复制能力,且抑制效果呈现明显的剂量依赖性。4 GO/HY对NDRV作用特征的研究采取不同用药方式,通过（基于SYBR Green）荧光定量PCR方法对比GO/HY对NDRV感染细胞不同作用阶段的抗病毒效果。结果如下:通过三种方式考察GO/HY体外抗NDRV活性,利用已建立的SYBR Green II荧光定量PCR方法,计算三种模式下,?C基因的相对表达量,结果发现:与提前加药组相比,感染后加药与同时加药组中,?C基因相对表达量明显降低,由此可见,GO/HY在NDRV感染DF-1过程中主要起作用的阶段为病毒侵入细胞的吸附阶段。5 GO/HY体内抗NDRV活性通过肌肉注射建立NDRV-TH11强毒株樱桃谷鸭雏鸭模型。接毒1-7 d后,分别用不同剂量GO/HY给鸭口服灌喂给药,并在停药后继续观察7天,结果如下:各剂量组GO/HY均能延长染毒鸭的存活时间。病毒感染组第3天开始出现死亡情况,5天后全部死亡,存活率为0,而药物治疗组存活时间延长,高剂量组存活率可达40%,说明GO/HY提高了染毒鸭的存活率。通过已建立的SYBR Green II实时PCR方法检测每个处理组中,鸭的肝脏和肺脏组织的病毒载量,结果发现,治疗剂量越高,其?C基因的转录水平越低,说明GO/HY对组织中的病毒载量具有明显的抑制效果。组织病理切片观察到GO/HY能够明显改善染毒鸭肝脏、肺脏组织的病变情况;且由免疫组化结果可知病毒在肝脏、肺脏组织中的分布随药物治疗剂量的增加而减少。本试验利用氧化石墨烯装载金丝桃素,同时探究该复合物GO/HY体内外抗NDRV效果,发现GO/HY可通过早期抑制NDRV靶基因的转录及靶蛋白的表达来抑制NDRV的复制。同时GO/HY可通过抑制NDRV在染毒鸭体内的复制来延缓其死亡时间,减轻染毒鸭靶器官的损伤。GO/HY对新型鸭呼肠孤病毒NDRV-TH11株体内及体外的抗病毒作用效果。