一、背景及目的肝纤维化是多种慢性肝病共同的病理改变,各种病因引起的慢性肝病或损害绝大多数都存在肝纤维化。肝纤维化是诸多肝病发展为肝硬化的必由之路,也是肝细胞肝癌的危险因素之一,其中25%-40%最终发展为肝硬化甚至肝癌。因此,肝纤维化是一类严重危害人类健康的世界性疾病。肝纤维化是一个动态的可逆性的病变过程。所以,深入研究肝纤维化的发病机制,寻找有效的治疗靶点,积极有效的逆转肝脏纤维化,对防治肝硬化与肝癌具有重大的广泛的经济价值、社会意义和应用前景。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)为一内分泌系统,具有广泛的生物学效应,作用于全身多个器官。RAAS在器官纤维化中起着重要的作用。除了循环系统中存在RAAS,诸多器官,心,肾,肺,胰腺都存在局部或器官内的RAAS,并且参与了组织器官纤维化和/或结构重构过程。肝脏局部也存在RAAS,以旁分泌、自分泌的方式发挥作用,参与肝纤维化的发展。这提示我们,RAAS可能是抗肝纤维化治疗的潜在靶点。以往认为,经典的肾素血管紧张素醛固酮系统作用轴ACE-Angll-AT1受体轴是其生物关联性的唯一体系,对肝纤维化的形成具有促进作用。最新研究发现,ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴亦为RAAS作用轴,是ACE-Angll-ATl受体轴的反向调节轴,对肝纤维化的发生具有保护作用。AngⅡ作为RAAS的主要功能成分,具有促进肝纤维化发展的重要作；而ACE2可裂解AngⅡ,生成Angl-7, Ang-(1-7)对AngⅡ具有负向调节,对肝纤维化具有保护作用。另一方面,在肝纤维化形成的过程中,细胞因子起了关键性的作用。细胞因子是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽,它们通过旁分泌或者自分泌的方式作用于靶细胞特定受体,发挥着局部生物学效应。在肝纤维化的形成过程中,转化生长因子β1(Transforming growth factor, TGF-β1)、结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor, CTGF)、肿瘤坏死因子-α (Tumor necrosis factor-α, TNF-α)存在表达的失衡,对肝纤维化的发生和发展起了重要的促进作用。当前,肝纤维化的治疗仍以药物为主,过去的10余年,RAAS阻滞剂中的血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂、醛固酮受体拮抗剂在心血管疾病、糖尿病、肾病等领域的地位被大量的循证医学证据所证实,而关于RAAS阻滞剂在肝病领域中的应用,多来源于回顾性、非对照前瞻性研究或者是有类似发病机制的其他疾病的治疗经验,对不合并心血管疾病、糖尿病、肾病的肝病患者仍不推荐应用RAAS抑制剂抗肝纤维化治疗,然而,对能耐受RAAS抑制剂的肝病患者,其积极作用也不能忽视,值得进一步研究。因此,本课题在前期研究工作的基础上,采用(Carbon tetrachloride, CCl4)诱导制备大鼠肝纤维化模型,选用血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂氯沙坦、醛固酮受体拮抗剂螺内酯,分别干预RAAS不同环节,观察其对大鼠肝组织病理形态学的影响,对血清透明质酸(Hyaluronidase, HA)、层粘连蛋白(Laminin, LN)、Ⅲ型前胶原(ProcollagenⅢ, PCⅢ)、 Ⅳ型胶原(Collagen Type Ⅳ, CⅣ), RAAS组分ACE2、AngⅡ、Ang (1-7),细胞因子TGF-β1、CTGF、TNF-α的影响,以期明确干预RAAS哪个环节抗大鼠肝纤维化作用最佳,并探讨其可能的作用机制,为肝纤维化的防治提供实验依据。二、方法取6周龄SD (Sprague Dawley, SD)大鼠50只,随机分为正常组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组和螺内酯组,每组各10只。正常组皮下注射橄榄油,3ml/kg;其余大鼠予40%CCl4腹壁皮下注射,3ml/kg,首剂加倍,1次/3d,制备大鼠肝纤维化模型；次日,卡托普利组用血管紧张素转换酶抑制剂卡托普利60mg/kg、氯沙坦组用血管紧张素Ⅱ的Ⅰ型受体阻断剂氯沙坦10mg/kg、螺内酯组用醛固酮受体拮抗剂螺内酯100mg/kg,均用10ml生理盐水稀释后灌胃,模型组和正常组用等量生理盐水灌胃,1次/d。于第8周处死各组大鼠,收集血液及肝组织标本。采用HE染色和Masson染色,光镜观察肝组织的病理形态学的变化；酶联免疫吸附测定法测定血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ及RAAS组分ACE2、AngⅡ、 Ang(1-7)的浓度；应用Real time-PCR检测肝组织TGF-β1mRNA、CTGFmRNA、 TNF-α mRNA的表达；Western blotting检测肝组织TGF-β1蛋白、CTGF蛋白、TNF-α蛋白的表达。三、数据分析数据用SPSS11.5软件进行分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示。方差齐时,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计分析,多重比较采用LSD-t法检验；方差不齐时,用近似方差分析的Welch法,多重比较采用Dunnett T3法检验,P<0.05为有统计学意义。四、结果所有大鼠无一脱失,均进入实验结果分析,无皮下脓肿,无自噬及舔咬。1.各组大鼠体重正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组体重差异有显著性意义(F=50.649,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,体重低于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,体重高于模型组,差异有显著性意义(P<0.01)。氯沙坦组、螺内酯组体重与卡托普利组相比差异无显著性意义(P>0.05)。2.各组大鼠肝湿重正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组肝湿重差异有显著性意义(F=36.137,P=0.000)。组间多重比较,正常对照组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,肝湿重低于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组肝湿重与正常对照组相比较,差异无显著性意义(P>0.05)。氯沙坦组、螺内酯组肝湿重与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。3.HE染色结果光镜下观察肝脏组织病理变化,正常组肝小叶结构正常,见肝细胞以中央静脉为中心向周围呈放射状排列,结构完整,肝细胞无变性坏死,成纤维细胞极少见到。模型组显示肝细胞索排列较紊乱,肝细胞出现脂肪变性,汇管区扩大,见假小叶形成。与模型组相比较,卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组汇管区稍微扩大,纤维间隔形成减少,未见假小叶形成。4. Masson染色结果正常组胶原纤维在血管周围有少量的表达；模型组胶原纤维增生明显,纤维间隔形成,可见弓形纤维,形成假小叶；与模型组相比较,卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组的胶原纤维明显减少,形成的纤维间隔亦明显减少,未见假小叶形成。5.各组大鼠肝纤维化半定量评分正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组肝纤维化半定量评分差异有显著性意义(welch值=354.152,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组肝纤维化半定量评分高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组肝纤维化半定量评分低于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)。氯沙坦组、螺内酯组肝纤维化半定量评分与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。6.各组大鼠肝纤维化面积百分比正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组肝纤维面积百分比差异有显著性意义(welch值=243.047,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组肝纤维面积百分比高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组肝纤维面积百分比低于与模型组,差异有显著性意义(P<0.05)。氯沙坦组、螺内酯组肝纤维面积百分比与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。7各组大鼠血清中HA. LN. PCⅢ、CIV水平7.1HA：正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组血清HA水平差异有显著性意义(F=121.629,P=0.000)。组间多重比较，模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组血清HA水平高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,血清HA水平低于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)；氯沙坦组、螺内酯组血清HA水平与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。7.2LN：：正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组血清LN水平差异有显著性意义(F=42.972,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,血清LN水平高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,血清LN水平低于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)；氯沙坦组、螺内酯组血清LN水平与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。7.3PCⅢ:正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组血清PCⅢ水平差异有显著性意义(F=213.310,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,血清PCⅢ水平高于正常对照组,差异有显著性意义((P<0.05))；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,血清PCⅢ水平低于模型组,差异有显著性意义((P<0.05)；氯沙坦组、螺内酯组血清PCⅢ水平与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。7.4CIV：正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组血清CIV水平差异有显著性意义(F=238.215,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,血清CIV水平高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,血清CIV水平低于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)；氯沙坦组、螺内酯组血清CIV水平与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。8各组大鼠血清ACE2、AngⅡ和Ang (1-7)水平8.1ACE2：正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组血清ACE2水平差异有显著性意义(welch值=310.273,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,血清ACE2水平高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,血清ACE2水平高于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)；氯沙坦组、螺内酯组ACE2水平与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。8.2AngⅡ:正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组血清AngⅡ水平差异有显著性意义(welch值=33.916,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,血清AngⅡ水平高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,血清AngⅡ水平低于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)；氯沙坦组、螺内酯组血清AngⅡ水平与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。8.3Ang (1-7):正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组血清Ang(1-7)水平差异有显著性意义(welch值=732.022,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,血清Ang(1-7)水平高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,血清Ang(1-7)水平高于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)；氯沙坦组、螺内酯组,血清Ang(1-7)水平与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。9各组大鼠肝组织ACE2、AngⅡ和Ang (1-7)水平9.1ACE2：正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组ACE2水平差异有显著性意义(F=229.378,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,ACE2水平高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,ACE2水平高于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)；氯沙坦组、螺内酯组ACE2水平与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。9.2AngⅡ:正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组AngⅡ水平差异有显著性意义(F=52.695,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,AngⅡ水平高于正常对照线，组差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组AngⅡ水平低于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)；氯沙坦组、螺内酯组AngⅡ水平与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。9.3Ang (1-7):正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组Ang(1-7)水平差异有显著性意义(F=210.254,P=0.000)。组向多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,Ang(1-7)水平高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,Ang(1-7)水平高于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)；氯沙坦组、螺内酯组Ang (1-7)水平与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。10各组大鼠肝组织TGF-β1mRNA、CTGF mRNA、TNF-αmRNA的表达10.1TGF-β1mRNA:正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组TGF-β1mRNA表达差异有显著性意义(welch值=162.836,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,TGF-β1mRNA表达高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,TGF-β1mRNA表达低于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)；氯沙坦组、螺内酯组TGF-β1mRNA的表达与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。10.2CTGF mRNA:正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组CTGF mRNA表达差异有显著性意义(welch值=41.175,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,CTGF mRNA表达高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,CTGF mRNA表达低于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)；氯沙坦组、螺内酯组CTGF mRNA表达与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。10.3TNF-αmRNA:正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组TNF-α mRNA表达差异有显著性意义(welch值=90.987,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,TNF-α mRNA表达高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,TNF-α mRNA表达低于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)；氯沙坦组、螺内酯组。TNF-α mRNA表达与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。11各组大鼠肝组织TGF-β1、CTGF、TNF-α蛋白的表达11.1TGF-β1蛋白：正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组TGF-β1蛋白的表达,差异有显著性意义(F=53.288,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组TGF-β1蛋白表达高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,TGF-β1蛋白表达低于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)；氯沙坦组、螺内酯组TGF-β1蛋白表达与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。11.2CTGF蛋白：正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组CTGF蛋白表达差异有显著性意义(welch值=36.304,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组CTGF蛋白的表达高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,CTGF蛋白表达低于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)；氯沙坦组、螺内酯组CTGF蛋白表达与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。11.3TNF-α蛋白：正常对照组、模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,各组TNF-α蛋白表达差异有显著性意义(welch值=41.812,P=0.000)。组间多重比较,模型组、卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,TNF-α蛋白表达高于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.05)；卡托普利组、氯沙坦组、螺内酯组,TNF-α蛋白表达低于模型组,差异有显著性意义(P<0.05)；氯沙坦组、螺内酯组TNF-α蛋白表达与卡托普利组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。结论1.本研究通过CCl4诱导,成功构建了的大鼠肝纤维化模型。2.干预RAAS不同环节均能够改善实验性肝纤维化大鼠的一般状态。3.干预RAAS不同环节均能改善大鼠肝脏组织病理学改变,降低大鼠血清HA、 LN、PCⅢ、CIV的水平,改善实验性肝纤维化大鼠的肝脏纤维化程度,且效果无优劣之分。4.干预RAAS不同环节抗肝纤维化的作用机制可能是通过升高循环和肝脏组织中ACE2、Ang (1-7)的水平,降低Angll的生成；并且下调肝组织中TGF-β1、 CTGF、TNF-α的表达有关。