论文部分内容阅读
目的：①观察TGFβ2和TGFβ2抗体作用于体外培养的人晶状体上皮细胞(hLEC)后，对细胞增殖、转分化特异性标记物αSMA和FN mRNA表达、信号通路转导蛋白Smad4动态表达的影响。②测定兔眼晶状体前囊膜片囊袋内再植入术后各时间点房水中总量和活性TGFβ2浓度，观察其波动规律。③活体观察TGFβ2和TGFβ2抗体作用于兔眼晶状体前囊膜片囊袋内再植入术后各时间点转分化特异性标记物αSMA和FN mRNA表达的差异。探索TGFβ2抗体影响LEC转分化的效果和机制。
方法：⑴体外培养的hLEC中分别添加A组10ng/ml hTGFβ2，B组0.3μg/mlTGFβ2抗体，C组10ng/ml hTGFβ2+0.3μg/mlTGFβ2抗体，对照组0.9％生理盐水。MTT法测定对细胞增殖的影响、RT-PCR方法测定8，16，24和48h各时点αSMA和FN mRNA的表达，Western blot方法观察2，8，16和24h各时点Smad4蛋白的表达。⑵20只新西兰白兔，一眼行晶状体超声乳化联合前囊膜片囊袋内再植入术，另一眼为对照。术后1，3，7，14和28d抽取术眼和对照眼房水样本，ELISA法测定总量和活性TGFβ2浓度。⑶在兔眼晶状体超声乳化联合前囊膜片囊袋内再植入术后3天囊袋内注射A组10ng/mlhTGFβ2，B组0.3μg/mlTGFβ2抗体，C组10ng/mlhTGFβ2+0.3μg/mlTGFβ2抗体，对照组平衡盐溶液各100μl，RT-PCR和实时荧光定量PCR方法测定术后5、10、15d囊袋组织样本中转分化标志物αSMA和FN mRNA的表达量，病理组织切片HE染色法和免疫组织化学法观察LEC、αSMA和FN蛋白的分布。
结果：①hLEC体外培养添加了TGFβ2和TGFβ2抗体后，MTT法检测A组(0.154±0.006) hLEC增殖受到抑制，与对照组(0.191±0.008)相比存在统计学显著差异(P<0.05)；B组(0.203±0.014)和C组(0.202±0.008) hLEC增殖未受到抑制，与对照组(0.191±0.008)相比无统计学显著差异(P>0.05)。RT-PCR法检测A组8h即可出现αSMA和FN mRNA表达并持续至48h，B组和对照组48h出现αSMA和FN mRNA表达阳性，C组24h和48h出现αSMA和FN mRNA表达阳性。Western blot法检测A组各时间点均可检测到Smad4蛋白，2h有表达(1.51g/L)，16h达到峰值(3.15g/L)。对照组、B组和C组在2h和8h Smad4蛋白相对含量较低。②ELISA法测定兔眼术后房水样本发现术后1d房水中总量TGFβ2浓度升高，维持较高水平超过术后28d；活性TGFβ2浓度术后1、3d下降，术后7d恢复至术前水平。③RT-PCR法检测，各组术后5d即可出现αSMA表达阳性，持续至术后15d。A组术后5d出现FN mRNA表达，持续至术后15d，B组、C组和对照组术后10和15d出现FN mRNA表达阳性。实时荧光定量PCR检测，术后5dA组(4.339±0.196)αSMA mRNA表达明显高于对照组(2.043±0.159)(P<0.05)，B组(0.797±0.023)和C组(1.214±0.121)αSMA mRNA表达明显低于对照组(2.043±0.159)(P<0.05)。术后10d A组(1.941±0.220)αSMA mRNA表达量明显高于对照组(1.494±0.054)(P<0.05)。B组(1.108±0.257)和C组(1.373±0.163)αSMA mRNA表达量与对照组(1.494±0.054)无统计学显著差异(P>0.05)。病理组织切片HE染色术后1d前囊膜LEC增殖，后囊膜未见LEC附着。术后3d后囊膜见LEC移行、附着。免疫组织化学法检测术后5d A组和B组囊膜间隙LECαSMA染色阳性。
结论：兔眼晶状体前囊膜片再植入术后房水中总量TGFβ2浓度升高，维持高水平超过28d；活性TGFβ2浓度降低，至术后7d恢复到术前水平。TGFβ2抗体可以对抗TGFβ2抑制LEC增殖的作用，减少通用型Smad4蛋白表达，减少LEC转分化标记蛋白αSMA和FN mRNA表达。TGFβ2抗体可在晶状体上皮细胞创伤后转分化过程中发挥一定作用。