目的建立巨细胞病毒特异性T淋巴细胞（cytomegalovirus specific T cells,CMV CTL）体外扩增的方法,通过实验证明经G-CSF动员的供者外周血干细胞采集物来源的CMV CTL具有抗巨细胞病毒作用,为临床开展过继免疫疗法治疗巨细胞病毒感染提供新的依据。方法用1μg/mL全长巨细胞病毒PP65（CMV pp65）多肽体外多轮刺激由粒细胞-集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF）动员的外周血干细胞采集物中分离的单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）,同时加入白细胞介素2（interleukin 2,IL-2）、IL-15、IL-21扩增20天。在培养第7天,加入丝裂霉素处理的负载CMV pp65抗原肽的自体PBMC,第10天补充经γ射线辐照处理并负载CMV pp65抗原肽的PBMC和CD3（OKT3）;对照组为未加入抗原肽进行扩增的PBMC组。采用多色流式细胞术分别对扩增前、扩增后的T淋巴细胞表型及细胞内肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和γ干扰素（interferon-γ,IFN-γ）的分泌水平进行分析,同时检测CD107a脱颗粒杀伤功能,并通过ELISA检测供者血清中CMV IgM/IgG抗体滴度水平。结果培养后可以收集得到（165.26±6.14）×10⁶个细胞,其中CD3⁺T细胞占89.21%,CD8⁺T细胞占CD3⁺T细胞的（43.54±28.03）%,CD4⁺T细胞占CD3⁺T细胞（34.23±26.18）%。获得的CD3⁺T细胞以效应记忆性T细胞(effector memory T cells,T_EM)为主,且扩增培养后的CD8⁺和CD4⁺T_EM比例较培养前显著增高。另外,培养后干细胞样记忆性T细胞(stem cell-like memory T cells,T_SCM)和组织原位记忆T细胞(tissue-resident memory T cells,T_RM)的比例均较培养前显著增加。在功能实验中,培养后得到的IFN-γ⁺分泌型CMV特异性CD8⁺T细胞群比例较扩增前明显增加,TNF-α⁺CMV特异性CD8⁺T细胞比例呈增长趋势;能够分别分泌IFN-γ和TNF-α的CMV特异性CD4⁺T细胞群比例与培养前无明显变化。培养后CD8⁺CMV特异性T细胞的CD107a表达水平为（3.28±1.97）%,与培养前无显著统计学差异。此外,供者体内CMV IgG水平与供者年龄呈现正相关,且在该培养体系下,IFN-γ⁺和TNF-α⁺CMV特异性T细胞扩增比例与供者年龄呈负相关。结论本研究成功建立了在体外有效扩增CMV CTL的方法,同时证明了由G-CSF动员的供者外周血干细胞采集物扩增得到的CMV CTL具有抗巨细胞病毒作用。