【背景】股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是由遗传因素和环境因素共同作用引起的复杂性疾病,致残率较高。ONFH的发病率呈逐年增加趋势,在美国每年有2万到3万新发病例,在中国每年约15万到20万新发病例。同时中国约有812万名ONFH患者,治疗ONFH仍然是骨科医生的难题。脂代谢紊乱被认为是ONFH发病的主要因素,在激素诱导和酒精诱导的ONFH的病变骨髓腔中脂肪堆积过多,血脂水平升高,且过量的激素已被认为是致病危险环境因素之一。激素诱导的股骨头坏死(steroid-induced osteonecrosis of femoral head,SONFH)核心病变环节被认为是骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨/成脂转分化异常,骨髓内脂肪细胞增多增大,病变坏死的髓腔中被大量脂肪填充压迫股骨头微血管引起骨细胞缺血性坏死,然而SONFH具体的分子发病机理仍不清楚。长链非编码RNA(long noncoding RNAs lncRNA)是转录本长度大于200bp且不编码蛋白质的RNA分子,参与调控细胞分化和基因表达所涉及的多种生物过程。近年来已有研究报道lncRNA在膝关节骨性关节炎、强直性脊柱炎、绝经后骨质疏松以及多发性骨髓瘤等骨科疾病的发生发展中具有重要作用。然而SONFH疾病转录组表达谱特别是BMSCs异常成脂、成骨分化过程中lncRNA、m RNA表达谱变化及相关调控作用尚未见报道。【目的】本研究以SONFH患者BMSCs成骨、成脂分化能力异常为切入点,联合应用lncRNA和m RNA表达谱分析及生物信息学集成分析方法,对病变干细胞成骨/成脂转分化能力改变过程中涉及的转录组学改变、相关信号通路的变化及其互作网络进行深入分析及验证,为临床SONFH防治提供潜在的诊断和治疗靶标。【方法】1.BMSCs分离、培养及相关检测:髋关节置换术中采集16名SONFH患者及16名骨折患者5~10ml股骨近端骨髓血,应用全骨髓组织贴壁法获取BMSCs并传代培养,分别进行细胞表面抗原分析、细胞周期检测、细胞增殖能力检测以及成骨、成脂分化能力检测。2.SONFH病变BMSCs差异表达lncRNA及m RNA筛查:选取3例SONFH患者BMSCs及3例骨折患者BMSCs通过高通量基因芯片筛查获取特异性lncRNA及m RNA表达谱,并通过q RT-PCR技术验证芯片准确性。3.SONFH病变BMSCs差异性表达lncRNA和m RNA生物信息学分析:通过数种生物信息学数据库联合分析包括:基因本体论(GO)分析、KEGG数据库、STRING、Star Base、Lnc Base,Anno Lnc以及Targetscan数据库,探讨差异表达基因与BMSCs成骨、成脂分化关系。4.lncRNA-HOTAIR在BMSCs成骨分化、成脂分化中的调控作用以及分子机制研究:通过敲低及过表达HOTAIR方法检测SONFH-BMSCs成骨及成脂分化能力变化,并通过经典“补救实验”方法对生物信息学预测结果:HOTAIR通过结合mi R-217调控DKK1表达进行验证,即敲低HOTAIR同时加入mi R-217抑制物、过表达HOTAIR同时加入mi R-217同源类似物后检测DKK1表达,最后通过敲低及过表达方法探讨HOTAIR对经典Wnt信号通路的调控作用。【结果】1.成功分离、培养SONFH病例组及对照组(骨折患者)BMSCs。SONFH组及对照组BMSCs均呈现纺锤形贴壁细胞的形态学特征,均具有典型的间充质干细胞表面标志:CD90,CD73和CD105阳性,CD34和CD45阴性,两组BMSCs细胞周期分布无显著统计学差异。SONFH组BMSCs增殖能力低于对照组,但无显著统计学差异。2.体外研究证实SONFH患者BMSCs成骨分化能力降低,成脂分化能力增强。与对照组相比,SONFH组BMSCs的ARS、ALP染色及定量分析显示成骨分化能力减弱,油红O染色及定量分析显示成脂分化能力增强。成骨分化标志物:骨形态发生蛋白2(BMP2)、骨保护素(OPG)、Runt相关转录因子2(RUNX2)表达显著下降(P<0.05),而成脂分化标志物:过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ),转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)和脂肪酶(Adipsin)表达显著增高(P<0.05)。SONFH患者BMSCs成骨分化标志物(RUNX2,Osterix)免疫组织化学染色弱于对照组,而成脂分化标志物(PPARγ,C/EBPα)免疫组织化学染色强于对照组。3.通过高通量芯片筛查SONFH疾病BMSCs差异表达lncRNA及m RNA。共发现3286个lncRNA和2775个m RNA差异表达(Fold Chang≥2.0,P<0.05)。选取10个差异表达lncRNA和10个m RNA通过q RT-PCR检测表达量,均与基因芯片表达趋势相同,验证了芯片的准确性及可靠性。4.通过生物信息学技术对差异表达lncRNA和m RNA进行深入分析,发现SONFH疾病BMSCs中差异表达的lncRNA和m RNA与成骨、成脂分化紧密相关。通过基因本体论(Gene ontology,GO)分析表明上调表达的差异基因主要富集在:单一生物过程,中间丝状体和生长因子活性(FDR<0.05,P<0.05),而下调表达的差异基因主要富集在:核碱基的化合物的代谢过程,细胞核和DNA结合(FDR<0.05,P<0.05)。KEGG数据库分析结果显示共计40条信号通路显著改变(P<0.05),包括上调信号通路16条下调信号通路24条。建立编码与非编码基因共表达(coding-non-coding,CNC)网络和内源竞争RNA(competing endogenous RNAs,ce RNA)调控网络深入分析阐述差异表达lncRNA与m RNA间的相互关系,发现lncRNA-HOTAIR、RP1-193H18.2、MALAT1,m RNA-Bmi1、DKK1、RECK、CTNNB1、JAK2、FOXO1、APC和DLX5均与调控BMSCs成骨、成脂分化密切相关。5.lncRNA-HOTAIR在调控SONFH患者BMSCs成骨、成脂分化中具有重要作用。低表达HOTAIR后SONFH患者BMSCs成骨分化能力增强、成脂能力减弱,而过表达HOTAIR后成骨分化能力减弱、成脂能力增强。通过RNA干扰实验发现HOTAIR通过结合mi RNA-217来调控DKK1表达,由于DKK1为Wnt/β-catenin信号通路抑制剂,且HOTAIR参与调控Wnt/β-catenin信号通路中关键基因OCT4及β-catenin表达,推测SONFH患者BMSCs中异常增高的HOTAIR通过Wnt/β-catenin信号通路抑制BMSCs成骨分化、促进成脂分化,为SONFH疾病提出发病相关的关键分子靶点及信号通路。【结论】1.获取了SONFH疾病BMSCs中lncRNA及m RNA特异性表达谱,共3286个lncRNA和2775个m RNA差异表达。2.通过多种生物信息学数据库及工具联合分析表明差异表达的lncRNA RP1-193H18.2,HOTAIR和MALAT1在SONFH病变BMSCs成骨/成脂异常转分化中的具有重要作用。3.与对照组相比SONFH组中HOTAIR表达显著上调,敲低或过表达HOTAIR可改变成脂及成骨分化能力。4.HOTAIR通过结合mi RNA-217促进DKK1表达,促进BMSCs成脂分化并抑制成骨分化,HOTAIR有望成为临床干预SONFH发病的潜在分子靶点。综上,我们的研究结果为SONFH致病分子机理提供了新的见解,为SONFH发生和发展过程中BMSCs异常成骨/成脂转分化的深入研究提供坚实基础,以期为SONFH早期防治提供关键分子靶点。