背景：肺纤维化（pulmonary fibrosis,PF）的发病率呈逐年上升趋势，发病机制未充分阐明，缺乏有效的治疗措施。TGF-β1/Smads(Transforming growth factor-β1/Smads)信号通路在肺纤维化发病中有着十分重要的作用。该通路激活后催化其效应因子Smad2、Smad3发生磷酸化活化，进而激活通路下游的相关纤维化靶基因转录，发挥致纤维化效应；Smad7是TGF-β1/Smads信号通路的负调控因子，具有阻遏Smad2、Smad3的磷酸化，从而抑制纤维化的重要作用。研究表明，在很多纤维化病变中，Smad7的蛋白水平明显下降，致使其对TGF-β1/Smads通路的抑制作用减弱，促进了纤维化的发生发展,然而与此同时，Smad7 mRNA水平往往是升高的，说明其基因转录未受抑制，蛋白质生成并未减少，提示Smad7蛋白水平下降的原因可能是其蛋白降解增多所致。目前对于肺纤维化中Smad7蛋白降解增多的原因及机制，尚不甚清楚，因此探索并阐明Smad7蛋白稳定性的调控机制，对于有效抑制肺纤维化发展具有极为重要的意义。Smad7蛋白降解的重要原因之一可能是由E3泛素连接酶Arkadia等催化其发生泛素化修饰，进而被蛋白酶体识别而发生。研究发现，Smad7的泛素化修饰位点位于多肽链N端第64，70位赖氨酸残基上，而该位点也能够结合乙酰基发生乙酰化修饰，提示Smad7的乙酰化修饰和泛素化修饰可能存在竞争性关系，推测处于乙酰化状态的Smad7蛋白能够避免被泛素化修饰而降解，从而增强Smad7蛋白的稳定性并发挥其生物学作用。但是在肺纤维化疾病中，Smad7蛋白水平是否受这两种修饰的调控，具体机制如何，并不清楚。蛋白质的乙酰化和去乙酰化是一个动态的可逆过程，Smad7去乙酰化反应主要由组蛋白去乙酰化酶1(Histone deacetylase1,HDAC1)催化发生。然而，在肺纤维化疾病中，Smad7乙酰化水平与HDAC1活性之间的关系如何，以及抑制HDAC1的活性，是否能够提高Smad7的乙酰化水平，从而增强Smad7蛋白稳定性，进而干预纤维化进程，迄今尚未见报道，有必要对此进行研究，以期进一步阐明Smad7蛋白稳定性的调控机制，并为肺纤维化防治寻找到新的治疗靶点。　　目的：观察肺纤维化病变中HDAC1、Smad7及相关纤维化指标的表达变化，探讨抑制HDAC1的活性是否能够影响Smad7乙酰化、泛素化水平、并增强Smad7的蛋白稳定性，以及由此对TGF-β1/Smads信号转导通路的调控和对肺纤维化病变的影响；探索肺纤维化中Smad7乙酰化修饰与其蛋白稳定性的关系、HDAC1影响Smad7蛋白表达水平的相关机制；从而阐明在肺纤维化发病中，HDAC1对调控Smad7蛋白稳定性的重要作用，为有效治疗肺纤维化提供理论和实验依据。　　方法：　　1.组蛋白去乙酰化酶抑制剂对肺纤维化中纤维化指标的影响：　　（1）体内实验：成年雄性SD大鼠，随机分为Saline组、PQ组、PQ+SAHA组。PQ组、PQ+SAHA组，采用百草枯(Paraquat，PQ)一次性腹腔注射(PQ15 mg/kg)染毒建立大鼠肺纤维化模型。PQ+SAHA组大鼠于染毒次日(d1)起给予SAHA(15mg/kg)-环糊精水溶液灌胃，1次/日，至d28；PQ组大鼠同期给予同浓度环糊精水溶液等量灌胃，1次/日，至d28；同时设鼠龄匹配的Saline组，PQ组、PQ+SAHA组大鼠染毒时给予生理盐水等量腹腔注射，次日起给予同浓度环糊精水溶液等量灌胃，1次/日，至d28。于d28处死大鼠，留取肺脏组织用作后续检测。通过HE、Masson染色光镜下观察肺形态学改变；免疫组织化学染色检测α-SMA和Collagen I(Col-I)蛋白表达；羟脯氨酸含量测定评价肺纤维化程度；实时荧光定量聚合酶链反应(Real time fluorescent quantitative-PCR，qRT-PCR)检测Col1a1(Col-I)的mRNA表达；Western blot检测α-SMA、E-cadherin(E-cad)、Col-I的蛋白水平。　　（2）体外实验：正常人肺成纤维细胞株HFL1的表型鉴定及SAHA浓度的筛选：通过细胞免疫荧光(Immunofluorescence,IF)染色检测HFL1的间充质细胞标志蛋白（波形蛋白，Vimentin）的表达，并排除其他相关平滑肌细胞可能，即不表达α-SMA；MTT法筛选出恰当的SAHA处理浓度。细胞随机分为control组（TGF-β1－/SAHA－）、SAHA对照组（TGF-β1－/SAHA＋）、模型组（TGF-β1＋/SAHA－）、SAHA干预组（TGF-β1＋/SAHA＋）。用TGF-β1（5ng/ml）刺激HFL1，SAHA（5μM）干预，处理48h。qRT-PCR检测COL1A1(Col-I)的mRNA表达，IF检测Col-I的蛋白表达，Western blot检测各组细胞中α-SMA、Col-I的蛋白表达水平。　　2.组蛋白去乙酰化酶抑制剂对肺纤维化中Smad7表达及TGF-β1/Smads通路的影响：　　（1）体内实验：上述各组大鼠肺组织，IF染色检测Smad7蛋白表达，qRT-PCR检测Smad7的mRNA表达，Western blot检测Smad7、TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白水平；　　（2）体外实验：上述各组细胞蛋白及RNA，qRT-PCR检测Smad7的mRNA表达，Western blot检测Smad7、Smad3、p-Smad3蛋白水平。　　3.组蛋白去乙酰化酶抑制剂对肺纤维化中Smad7乙酰化和泛素化水平的影响：　　（1）体内实验：上述各组大鼠肺组织，Western blot检测HDAC1、Arkadia蛋白水平，qRT-PCR检测Rnf111(Arkadia)的mRNA表达；　　（2）体外实验：比色法检测模型组细胞24h、48h、72h HDAC1的活性变化，再检测各组细胞48h HDAC1的活性变化；qRT-PCR检测Smad7、RNF111(Arkadia)的mRNA表达；Western blot检测各组细胞中HDAC1、Arkadia的蛋白水平；免疫沉淀/免疫印迹（IP/IB）方法检测各组细胞中Smad7乙酰化水平、泛素化水平；IF检测Smad7、HDAC1的细胞内定位，免疫共沉淀/蛋白印迹（Co-IP/IB）验证两者之间的相互作用。　　4.敲低HDAC1表达对Smad7乙酰化水平、蛋白稳定性及肺纤维化中成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响：采用HDAC1-shRNA的质粒表达载体转染HFL1细胞，敲低HFL1中HDAC1 mRNA的表达，并给予TGF-β1刺激促进肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。筛选出转染效果最好的质粒shRNA序列及恰当的质粒转染剂量后，进行转染，细胞分组：Blank+T组（空白对照组，不加任何转染试剂及质粒）、Scramble+T组（阴性质粒对照组，转染HDAC1-shRNA阴性质粒）、Mock+T组（转染试剂对照组，转染时只加同等剂量转染试剂，不加入质粒）及HDAC1-sh+T组（HDAC1敲低组，转染筛选出的最佳质粒）。各组细胞转染6h后换为含2％FBS+TGF-β1(5ng/ml)的DMEM培养基，继续培养48h后提取细胞RNA和蛋白。qRT-PCR检测Smad7、COL1A1的mRNA表达，Western blot及IP/IB检测Smad7、Col-I蛋白水平和Smad7的乙酰化、泛素化水平。　　结果：　　1.组蛋白去乙酰化酶抑制剂能抑制肺纤维化相关纤维化指标的表达：　　（1）PQ组大鼠肺组织形态学改变（肺脏体积缩小、颜色较白、质硬,表面见纤维结节样改变，凹凸不平，并可见陈旧出血点；HE染色见肺泡结构破坏，肺泡腔融合、塌陷，肺泡间隔增厚，肺间质内大量炎性细胞浸润，成纤维细胞增生，Masson染色见大量胶原纤维沉积）和肺组织羟脯氨酸含量测定表明大鼠肺纤维化模型复制成功，使用SAHA（PQ+SAHA组大鼠）能在一定程度上减轻肺形态结构的破坏，并显著降低肺组织羟脯氨酸的含量；在肺纤维化动物中，大鼠肺组织α-SMA、Col-I蛋白水平上升而E-cad蛋白水平下降，Col-I mRNA表达增加；加予SAHA处理，大鼠肺组织α-SMA、Col-I蛋白水平下降而E-cad蛋白水平上升，Col-I mRNA表达减少。　　（2）在体外实验中，TGF-β1刺激HFL1细胞后，α-SMA、Col-I蛋白水平上升，Col-I mRNA表达增多；加予SAHA处理，α-SMA、Col-I蛋白水平降低，Col-I mRNA表达减少。　　2.组蛋白去乙酰化酶抑制剂能上调Smad7蛋白水平，阻遏TGF-β1/Smads通路的转导：　　（1）肺纤维化动物中，大鼠肺组织Smad7蛋白水平降低、TGF-β1、p-Smad3蛋白水平升高，Smad7 mRNA表达增多；加予SAHA处理，大鼠肺组织Smad7蛋白水平上升、TGF-β1蛋白水平无明显变化、p-Smad3蛋白水平下降，Smad7 mRNA表达进一步增多。　　（2）在体外实验中，TGF-β1刺激HFL1细胞后，Smad7蛋白水平降低、p-Smad3蛋白水平升高，Smad7 mRNA表达增多；加予SAHA处理，细胞的Smad7蛋白水平上升、p-Smad3蛋白水平下降，Smad7 mRNA表达进一步增多。　　3.组蛋白去乙酰化酶抑制剂上调Smad7乙酰化水平、降低Smad7泛素化水平：　　（1）与Saline组大鼠比较，PQ组大鼠肺组织HDAC1蛋白水平升高、Arkadia的mRNA和蛋白水平均升高；加予SAHA处理，大鼠肺组织HDAC1蛋白水平下降、Arkadia mRNA和蛋白水平均进一步升高。　　（2）TGF-β1刺激HFL1细胞后，HDAC1的活性和蛋白水平升高、Arkadia的mRNA和蛋白水平升高、Smad7乙酰化水平降低、Smad7泛素化水平升高；加予SAHA处理，HDAC1的活性和蛋白水平降低、Arkadia的mRNA和蛋白水平进一步升高、Smad7乙酰化水平上升、Smad7泛素化水平降低。　　4.敲低HDAC1表达能上调Smad7乙酰化水平、降低Smad7泛素化水平、提高Smad7蛋白水平，抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化：在TGF-β1刺激的体外环境中，敲低HFL1细胞的HDAC1 mRNA表达，与正常表达HDAC1 mRNA的HFL1细胞比较，HDAC1 mRNA和蛋白水平下降约70%，Smad7的乙酰化水平上升、泛素化水平下降、蛋白水平升高，Smad7 mRNA表达增多，Col-I mRNA和蛋白水平均降低。　　结论：　　1.在肺纤维化组织细胞中，HDAC1蛋白表达增多、活性增强，与此同时，Smad7蛋白水平显著降低，并因此促进了TGF-β1/Smads信号通路的转导，使其发挥重要的致纤维化作用；　　2.组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA能够降低纤维化肺组织和细胞中HDAC1的蛋白水平和活性，提高细胞内Smad7乙酰化水平、降低其泛素化水平，使得Smad7的蛋白水平增高，抑制了TGF-β1/Smads通路的致纤维化效应；　　3. HDAC1具有降低肺纤维化组织中Smad7蛋白水平的重要作用。敲低细胞中 HDAC1的表达，能够提高Smad7的乙酰化水平，抑制其泛素化修饰，维持其蛋白稳定性和生物学作用，从而发挥抗纤维化效应，研究结果为有效治疗肺纤维化提供了理论和实验依据。