一、背景与目的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是由严重感染、创伤、中毒等多种病因导致肺组织产生广泛而过度的炎症反应[1-3],可进展成为急性呼吸窘迫综合征即ARDS(acute respiratory distress syndrome)而危及生命。其发病机制复杂,病死率高。炎性细胞及炎性介质的调控失调是导致ALI最重要的发病机制之一。对于ALI的药物治疗,尽管既往研究发现抗炎疗法具有降低肺损伤的潜在功效,但临床试验并没有取得令人信服的证据来证明糖皮质激素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、抗氧化剂等药物能显著降低ALI患者的病死率4[6]。因此,亟待研发更为有效的ALI治疗药物以服务患者。多项研究显示,microRNAs(miRNAs)参与ALI的发病调控[7,8],其具有调节炎症和免疫反应的潜能。因此,研究ALI药物治疗前后机体内miRNAs表达的变化情况,也成为找寻药物作用靶点的重要途径。ALI患者即便有幸渡过急性危险期,但幸存者仍可能出现长期后遗症,包括进展为慢性肺纤维化疾病而造成肺功能障碍,影响生活质量。肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)是由多种病因导致的慢性间质性肺疾病,患者5年生存率仅20%[9],其机制也尚未完全明确。目前治疗PF的新药主要是吡非尼酮(pirfenidone)和尼达尼布(Nintedanib)[10,11],但其价格昂贵,普通患者难以承受长期服药的费用支出。此外,我国至今仍无自主知识产权的抗PF药物。因此,研发具有我国自主知识产权的经济、高效、低毒的抗ALI及抗PF药物十分必要。龙胆苦苷(gentiopicroside,GPS)为苦胆草的主要有效成分,具有保肝、止痛、抗感染、抗脓毒血症相关性ALI等多种药理作用[12-15]。但GPS抗ALI的机制仍不明确,目前更缺乏GPS抗PF的研究报告。基于以上原因,本研究采用GPS干预模型小鼠ALI及PF的病变过程,从病理形态学、蛋白及基因表达水平等方面研究GPS对于ALI及PF的防治作用。此外,以miRNA表达谱芯片技术检测模型小鼠ALI病变前后miRNAs表达水平的变化,以期进一步明确GPS抗ALI的作用机制,并探索GPS是否具有抗PF的作用及其作用机制,为GPS防治ALI及慢性PF的研发提供实验依据。二、方法:1.分别建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的ALI小鼠模型及博来霉素(Bleomycin,BLM)诱导的慢性PF小鼠模型。2.肺组织常规HE染色、Masson染色、电子显微镜及NF-κB免疫组化染色等病理形态学检测,观察肺组织炎症、纤维化等病变及NF-κB蛋白表达情况。3.BCA(Bicinchoninic acid)法检测气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid,BALF)中总蛋白含量,ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)测定BALF中TNF-α、IL-1β等细胞因子含量。BALF细胞涂片计数细胞数及分类细胞比例。4.采用试剂盒测定肺组织羟脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)及丙二醛(Malonaldehyde,MDA)的含量。5.Western blot 检测肺组织 AQP1、AQP5、TGF-β1、CTGF 等蛋白含量。6.qPCR检测AQP1及AQP5基因表达情况。7.miRNAs基因芯片检测GPS干预ALI病变前后肺组织miRNAs表达变化情况。8.体外实验,GPS干预经TGF-β1刺激的A549细胞,细胞免疫染色检测刺激前后细胞E-cathrin和α-SMA表达变化情况,以了解GPS对于A549细胞受TGF-β1 刺激发生上皮细胞-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。三、结果1.病理形态学检测显示LPS致ALI模型小鼠肺组织呈现弥漫性肺泡炎、肺组织严重水肿等病变,BLM致慢性PF模型小鼠肺组织表现为显著肺纤维化及炎症等病变。2.细胞涂片、ELISA、qPCR、Western Blot及免疫组化染色等检测显示,与生理盐水(normal saline,NS)组相比,ALI模型组小鼠BALF中蛋白总量、细胞总数、炎性细胞比例、TNF-α、IL-1β含量及肺组织中NF-κB蛋白表达均明显增加(P<0.05),而肺组织中AQP1及AQP5基因、蛋白表达均明显降低(P<0.05)。与ALI模型组相比,GPS干预组BALF中蛋白总量、细胞总数、粒细胞比例、TNF-α、IL-1β含量及肺组织中NF-κB蛋白表达均明显降低(P<0.05),而肺组织中AQP1及AQP5基因、蛋白表达均明显增加(P<0.05),且高剂量组相应变化更明显、疗效与地塞米松组相当(P>0.05)。3.肺组织匀浆MPO、MDA及SOD检测显示,与NS组相比,ALI模型组小鼠肺组织中MDA、MPO含量明显升高而SOD含量显著下降(P<0.05);与ALI模型组相比,GPS干预组其MDA、MPO含量明显降低而SOD含量明显升高((P<0.05),且高剂量组变化更为显著(P<0.05)。4.细胞涂片、Hpy含量、Western Blot及ELISA等检测显示,与NS组相比,同期PF模型组小鼠BALF中蛋白总量、巨噬细胞比例、TNF-α、IL-1β含量,肺组织中Hpy含量、TGF-β1及CTGF蛋白表达,均明显增加(P<0.05)。与PF模型组相比,同期GPS干预组肺组织及BALF中相应巨噬细胞比例、蛋白及细胞因子的含量均显著降低(P<0.05)且高剂量组下降更明显、疗效与DXM组相当(P>0.05)。5.免疫组化检测显示,与对照组相比,模型组A549经TGF-β1刺激后E-Cadherin阳性细胞率降低而α-SMA上升(P<0.05)。与模型组相比,GPS干预后E-Cadherin阳性细胞率明显增加而α-SMA显著降低,疗效与DXM组接近(P>0.05),且呈现剂量相关性。6.miRNAs芯片检测共筛选出60个小鼠ALI致病相关性miRNAs,其主要参与显著的信号通路共36条,其中6条上调,30条下调;参与炎症及免疫反应调控的主要信号通路分别有6条及3条。7.Go-pathway分析显示,对于小鼠ALI的治疗,GPS及DXM均有药效的调控靶miRNAs共18个,且12个为上调,共调控885个预测的交集靶基因,参与了5条显著信号通路的调控。8.microRNA-Gene-Net分析显示,在LPS致小鼠ALI病变过程中,网络内度值最高的miRNAs为mmu-miR-124-3p和mmu-miR-6394,最高的基因则为Amot 和 B3gat2。四、结论:1.GPS能显著拮抗LPS致小鼠ALI病变。其作用机制为,通过降低BALF中蛋白渗出、细胞总数、粒细胞比例、TNF-α及IL-1β含量,下调肺组织中NF-κB蛋白,上调AQP1、AQP5基因及蛋白的表达,抑制肺组织中MDA及MPO活性,提高肺组织中SOD活性。2.在LPS致小鼠ALI病变过程中,起调控作用最强的两个miRNAs为mmu-miR-124-3p 和 mmu-miR-6394;Amot、B3gat2 等基因是被相对较多的miRNAs所调控的靶基因。3.对于LPS致小鼠ALI的治疗,GPS及DXM具有18个共同的药效调控靶miRNAs,且12个为上调。4.GPS能持续且显著的抑制BLM致慢性PF小鼠肺组织的炎症及纤维化病变。其作用机制为,通过减轻肺泡腔内分泌促纤维化因子的巨噬细胞渗出比例,降低BALF中TNF-α及IL-1β含量,下调肺组织中TGF-β1及CTGF蛋白的表达。5.GPS可抑制A549经TGF-β1诱导的EMT过程。肺泡上皮细胞及TGF-β1可能是GPS防治PF的关键性靶细胞及靶分子。