体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)是一项具有巨大应用前景的繁殖新技术,其在良种家畜扩繁、转基因动物生产、珍稀物种保护、功能性药物蛋白生产以及发育生物学、细胞生物学、胚胎学等众多领域具有广泛的潜在应用价值。因此,SCNT技术在科研、工业和农业上可产生巨大经济效益。目前,利用SCNT技术获得了大批克隆牛后代,然而牛SCNT技术的总体效率目前仍然很低,其整体效率只有5-10%。本论文旨在建立日本黑毛和牛体细胞核移植胚胎技术方法,生产克隆胚胎并移植。本论文包括三个试验,具体试验内容及获得结果如下:(1)试验1:研究并建立了成年和牛耳组织和胎儿组织2种成纤维细胞系,研究比较了这两种细胞系的生长发育特征、形态和染色体的倍性,试验结果表明,成年和牛和胎儿成纤维细胞系稳定,具有正常的生物学特性;(2)试验2:提高和牛体细胞核移植胚胎生产效率的研究。首先比较了来源于两种不同供体细胞系(胎儿和耳部皮肤成纤维细胞)克隆胚胎的发育率,结果表明,不同细胞系克隆胚胎的卵裂率和囊胚率差异不显著;其次研究了冷冻方法对克隆胚胎发育效率的影响,试验结果表明,使用90%细胞成簇生长时冻存的成纤维细胞做供体细胞,其卵裂率(90.7%)高于常规冷冻保存方法的供体细胞(84.4%),但两者的囊胚率没有显著差异(27.2%和31.0%);第三研究了不同去核方法对体细胞克隆胚胎生产的影响,结果表明,地美可辛(demecolcine)处理卵母细胞时,卵母细胞去核率(96.0%)高于对照组(79.5%),但两种去核方法的卵裂率和囊胚率没有明显差异。卵母细胞培养16 h后与地美可辛孵育2 h核脱出率(57.5%)高于对照组(4.7%)和其他方法(IVM 16 h后,去除卵丘细胞并在DEM中培养2 h)(54.5%);第四研究了徒手克隆方法对克隆胚胎生产效率的影响,结果表明,徒手无透明带克隆方法的卵裂率和囊胚率(90.6%,27.5%)高于常规注射方法(63.8%和12.0%)。徒手克隆时,供体细胞双细胞质融合(2胞质和1个供体细胞)的卵裂率和囊胚率高与单细胞质融合(1胞质和1个供体细胞)。无透明带和牛克隆囊胚移植到受体牛,共有获得4头克隆犊牛后代(2犊牛来源于和牛耳成纤维细胞克隆胚胎,2犊牛来源于和牛胎儿成纤维细胞克隆胚胎),其中1头犊牛出生时死亡,1头犊牛出生后1周死亡;(3)试验3:研究组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)CUDC-101对和牛克隆胚胎体外发育的影响。试验结果表明,当用5μM以上CUDC-101处理供体细胞时,卵裂率,囊胚率和总细胞数均高于对照或2μM CUDC-10组,但是,高浓度CUDC-101(大于100μM)处理和牛胚胎时,其发育率降低,当浓度为250和500μM时无克隆胚胎发育到囊胚阶段。与对照或CUDC-101处理48 h相比,处理24 h时效果较好。定量PCR检测结果表明,CUDC-101处理组Oct4和CDX2基因的表达水平显著高于对照组,但是与早期胚胎表观遗传相关的DNMT1和HDAC1基因表达水平显著下调。本实验建立了和牛体细胞克隆的技术方法。当90%和牛成纤维细胞成簇生长时进行冻存,解冻后的细胞可直接用于制备供体细胞;地美可辛处理可有效去核;无透明带核移植法可提高克隆胚胎生产效率;CUDC-101处理和牛成纤维细胞能够改善体细胞核移植胚胎的体外发育效率,可上调OCT4,CDX2的表达和下调DNMT1和HDAC1基因的表达。