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普通菜豆(Phaseoleae vulgaris L.)是人类主要食用豆类作物之一,干旱、盐害等逆境已成为影响普通菜豆生产的主要限制因素。因此,研究普通菜豆抗逆分子机理,发掘并利用抗旱、耐盐基因,改良普通菜豆品种,对保障我国粮食安全、降低生产成本具有重要理论和现实意义。本研究利用候选基因法克隆普通菜豆脯氨酸合成酶基因P5CS,应用实时定量PCR分析基因对逆境胁迫的应答,通过转化模式植物研究其抗逆功能,并应用直接测序法检测基因的单核苷酸多态性(SNP),获得以下结果:1、克隆出两个普通菜豆脯氨酸合成酶基因,分别命名为PvP5CS1和PvP5CS2。PvP5CS1基因全长2.246 kb,具有一个2.151 kb的开放阅读框;PvP5CS2基因全长2.340 kb,包含一个2.148 kb的开放阅读框,其DNA序列包含20个外显子和19个内含子。PvP5CS1和PvP5CS2基因与豇豆VaP5CS基因核苷酸序列的相似性分别为95.1%和82.6%,氨基酸序列的相似性分别为93.2%和79.9%。两个基因都包含有高等植物P5CS蛋白质的主要功能域:ATP结合位点、2个亮氨酸结构域、NADPH结合位点、谷氨酰激酶结构域和谷氨酸半醛结构域。2、PvP5CS1和PvP5CS2基因的表达明显受干旱、NaCl和低温诱导。干旱胁迫下,叶片中两个基因的表达在第4天达到最大值,脯氨酸的积累到第8天才达到最大值。盐胁迫2 h,叶片中两个基因出现表达高峰,根中到6 h才达到最大值,但是脯氨酸含量的最大值都出现在第9 h。冷处理2 h,诱导叶片中两个基因和根中PvP5CS2基因达到表达高峰,叶片和根中脯氨酸积累的高峰分别出现在第12 h和24 h,冷胁迫抑制PvP5CS1基因在根中表达。3、正常条件(CK)、渗透胁迫(150 mM和250 mM甘露醇)和盐胁迫(150 mM NaCl)下,转PvP5CS1基因拟南芥株系平均脯氨酸含量分别是野生型的1.38、2.68、1.30和1.30倍。转基因拟南芥的渗透耐性、耐盐性和抗旱性得到改善。在150 mM NaCl和150 mM甘露醇胁迫下,转基因株系种子的发芽率显著高于野生型(P<0.001),幼苗相对电导率比均显著低于野生型,根长显著大于野生型(P<0.05);300 mM NaCl处理15 d,转基因株系幼苗的存活率显著高于野生型(P<0.05);干旱胁迫下,转基因株系的存活率大于野生型。4、转PvP5CS2基因烟草植株表现出较强的抗旱性,在水分胁迫条件下,转基因植株脯氨酸含量、叶片萎蔫数和叶片相对含水量分别是野生型的2.3倍、0.88倍和1.26倍。5、在27份普通菜豆的PvP5CS2中共发现63个SNP位点,其中编码区18个,非编码区45个,转换:颠换为1.25:1;插入缺失位点224个,全部出现在内含子区域。PvP5CS2是一个相对保守的基因,在进化过程中受到强烈负选择影响(Ka/Ks<0.5),核苷酸多样性值(π)为0.00483,安第斯基因库和中美洲基因库内部核苷酸的变异低于基因库之间的变异。PvP5CS2基因的单核苷酸多态性和普通菜豆的抗旱性没有直接关系,但与普通菜豆的起源密切相关。6、基于普通菜豆G19833和DOR364基因组序列之间的插入缺失开发的扩增片段长度多态性分子标记Pv97,能有效追踪普通菜豆的基因源。根据Pv97标记在重组近交系(G19833×DOR364)中的多态性,将PvP5CS2基因定位在b01染色体上。7、洋葱鳞茎表皮细胞的瞬时表达结果显示,PvP5CS1和PvP5CS2定位于细胞膜和细胞核。