肿瘤转移抑制蛋白Mtss1 (Metastasis suppressor 1;又名MIM,Missing in Metastasis)被认为是一种肿瘤转移相关的肌动蛋白结合蛋白。已有报道显示Mtss1参与细胞微丝系统的调控,具有强烈的细胞形态诱导功能。在细胞系中过量表达Mtss1可以诱导丝状伪足类似结构(filopoidia-like structure)与片状伪足类似结构(lamellipodia-like structure)的形成,并导致应力纤维(stress-fiber)的减少。同时,Mtss1的过量表达影响细胞运动及相关背部变皱膜结构(dorsal ruffling)。信号通路研究显示它介入Src激酶,小GTPase Rac介导的细胞形态与细胞运动相关信号通路。然而,目前的报道还不能回答的一个问题,就是内源Mtss1在生物体内的功能究竟是什么?作为发育相关的蛋白质,很多成熟分化的组织或细胞中的Mtss1均呈现非常低的表达,使得目前功能研究中使用的细胞系中内源Mtss1处于很低的状态,功能研究多以过量表达的方式进行。值得庆幸的是,Mtss1在小脑浦肯野神经元发育成熟后仍维持较高水平的表达,这为内源Mtss1功能研究模型的建立带来了一线曙光。浦肯野神经元是中枢神经系统中树突结构最为复杂的神经元,并且分化后仍具有可塑性,是研究运动学习的经典模型之一。肌动蛋白微丝系统在神经元的形态发生和可塑性中起主要作用。伴有认知障碍的神经疾病以及神经退行性疾病,经常伴有细胞骨架蛋白的异常。已有报道与我们未发表的结果表明,Mtss1在小脑出生后发育过程中呈现表达高峰并在成熟分化后维持较高表达,且Mtss1在该神经元胞体、轴突与树突中均有表达,暗示它可能参与该神经元形态相关的功能。与过量表达(over-expression)相对,knock-down或knock-out技术导致目标蛋白表达降低或缺失是功能研究的常用手段之一,两者相辅相成,结果互为印证。与knock out技术相比,knock down技术要求低,投入少,已在功能研究中广泛应用。其中的RNA干扰技术(RNA interference RNAi)通过双链RNA的介导,特异性阻抑相关序列的表达,从而导致转录后水平的基因沉默。RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术,近年来发展迅速,已被广泛的应用于功能基因组研究。慢病毒介导的RNA干扰适用于包括神经元在内的非分裂期细胞,而且效率高。以它为工具来探索Mtss1在浦肯野神经元中的功能比较合适,所以在我们的实验设计中拟采用慢病毒感染的方法对浦肯野神经元的内源Mtss1进行knock down。为了制备针对Mtss1的高效慢病毒,我们首先针对小鼠Mtss1基因,利用Invitrogen公司的在线设计软件BLOCK-ITTM NAi Designer (https://rnaidesigner. invitrogen. com/rnai)设计三对特异性shRNA序列。送至上海生物工程有限公司合成。接着,为检测这三段序列的有效性,我们将合成的shRNA片段连接到shRNA干扰载体pSUPER-retro-puro中,经酶切和测序鉴定干扰载体构建成功,将之瞬间转染GFP-Mtssl过量表达的细胞系中,利用western blot检测knock down的效率,结果显示三段序列干扰效率均达60%以上。在验证了序列的有效性之后,利用EcoRⅠ-ClaⅠ双酶切将含目的序列的DNA片段切下来连接到PLVTHM’慢病毒质粒中,经酶切和测序鉴定,表明Mtss1的慢病毒干扰载体构建成功。此后,我们采用含有shRNA序列的慢病毒载体质粒pLVTHM、衣壳蛋白质粒pMD 2.G和包装蛋白质粒psPAX2共转293T细胞的方法,制备慢病毒,经纯化后测定病毒滴度。用慢病毒感染GFP-Mtss1过量表达的细胞系中,再次利用western blot的方法测定慢病毒Mtss1 shRNA的有效性,结果显示三段序列在慢病毒载体中的干扰效率也均达60%以上。为进一步探索这些慢病毒感染浦肯野神经元的有效性,我们采用慢病毒感染原代培养的浦肯野神经元,免疫荧光的初步结果显示制备的慢病毒可以实现有效感染。由于浦肯野神经元细胞不分裂增殖,每次原代培养获得的浦肯野神经元量较少。所以慢病毒介导的RNAi对浦肯野神经元中的Mtss1的knock down的效率测定和进一步的形态学观察有待继续深入。总之,这个工作对于在细胞水平乃至整体动物水平上研究内源Mtss1在浦肯野神经元形态发生与功能方面的作用是关键的,为后续的研究工作建立了良好的基础。