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结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的消化道恶性肿瘤,其发病率正逐年升高,每年有超过一百万例CRC患者确诊,60万名患者死于该病,是世界上第三个常见的癌症。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)作为最常用的治疗CRC的化疗药物,至今尚未阐明确切的耐药机制,但是,启动DNA损伤修复机制是CRC细胞产生5-Fu耐药的原因之一;我们前期结果发现共刺激分子B7-H3高表达的CRC细胞能显著降低对5-Fu的敏感性。因此,本课题进一步从B7-H3调控DNA损伤修复的角度,研究B7-H3在CRC细胞5-Fu耐药中发挥的作用。本课题组前期自主构建了两对CRC稳转细胞株,高表达B7-H3的SW480-B7-H3及其对照株SW480-NC和敲减表达B7-H3的HCT-8-shB7-H3及其对照株HCT-8-NC。MTT法结果显示B7-H3高表达CRC细胞的对5-Fu耐药指数明显高于其低表达;克隆形成实验结果显示B7-H3高表达CRC细胞具有更强的细胞增殖能力。由于5-Fu作用机制为损伤细胞DNA,可用彗星实验的方法检测细胞DNA的损伤程度,结果显示B7-H3高表达CRC细胞对于5-Fu造成的DNA损伤明显弱于其低表达。因此,以上这些结果揭示了B7-H3通过增加DNA损伤修复能力从而拮抗5-Fu造成的DNA损伤,是CRC细胞对5-Fu耐药的一个重要的因素。接下来是探索B7-H3如何调控细胞DNA的损伤修复。根据前期CRC细胞株mRNA基因芯片结果发现,上调B7-H3表达后CRC细胞中BRCC3也高表达。因此,为了进一步的证实芯片结果,qRT-PCR结果显示B7-H3高表达稳转细胞株中BRCC3也高表达;B7-H3敲减的稳转细胞株中的BRCC3也低表达;Western blot结果得到了同样的证实;免疫荧光激光共聚焦结果发现B7-H3与BRCC3成正相关,并且Western blot结果显示细胞通过5-Fu处理后BRCC3发生了核转移。由于BRCC3是DNA损伤修复的关键蛋白,5-Fu处理后入核参与DNA修复。所以,B7-H3可能是通过调控BRCC3从而促进CRC细胞对5-Fu的耐药。实验结果证明了B7-H3的表达与BRCC3表达成正相关性,但BRCC3是否是B7-H3拮抗5-Fu的一个关键蛋白,我们通过特异性针对BRCC3的siRNA抑制细胞BRCC3的表达,Western blot和免疫荧光激光共聚焦结果显示BRCC3在B7-H3高表达SW480-B7-H3细胞中表达降低;克隆形成实验结果显示在SW480-B7-H3细胞中敲减BRCC3后增殖能力变弱;细胞周期结果发现BRCC3敲减后,G2/M期细胞比例明显增加,降低了关卡对DNA损伤的检查;彗星实验结果显示BRCC3敲减后SW480-B7-H3细胞的DNA损伤修复能力变弱,对于化疗药物5-Fu敏感性增强。因此,实验结果显示B7-H3上调BRCC3的表达,增加对DNA损伤后的修复能力,从而成为CRC细胞对5-Fu耐药的一个重要的原因。我们研究结果首次证明了B7-H3调控BRCC3的表达,增加CRC细胞对DNA损伤的修复能力,减弱5-Fu引起的细胞损伤,降低肿瘤细胞对5-Fu的敏感性。这些结果表明通过靶向B7-H3过表达或相关信号通路可以作为逆转5-Fu耐药的一个新的方向。