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[目的]药疹是一种常见的药物不良反应,严重时可引起重型药疹,甚至危及生命,因此备受关注。但药疹的机制尚不明确。CCL17/CCR4轴参与过敏性疾病的免疫机制,但在药疹中的作用未见报道。因此,我们将探讨CCL17/CCR4轴在药疹中的作用机制。[方法]我们利用表达谱芯片初步筛查HIV感染合并重型药疹患者(HIV+SDE+)、非HIV感染的重型药疹患者(HIV-SDE+)和艾滋病非药疹患者(HIV+SDE-)外周血血清的趋化因子蛋白表达差异,通过生物信息学分析显著差异趋化因子富集情况,明确HIV感染者合并重型药疹和普通人群重型药疹的免疫机制差异,同时找到了两种人群中重型药疹的共同机制。因此,收集了HIV+SDE+HIV-SDE+HIV+SDE+、HIV-SDE+、HIV+SDE-患者和健康者(Healthy donors)外周血,使用ELISA试剂盒检测四组患者血清中差异表达的趋化因子水平。进一步从临床-细胞-动物模型三方面对CCL17/CCR4轴在药疹中的机制进行研究。1.在临床实验中,通过流式细胞术(Flowcytometry,FCM)检测四组患者外周血PBMC中CD4+T、Th1、Th2细胞亚群表达情况。ELISA试剂盒检测四组患者血清中IL-4和IL-13水平。最后通过流式细胞术检测CCL17在CD4+T细胞表达情况,说明CCL17的来源。2.在体外实验中,购买D10.G4.1小鼠Th2细胞株,通过CRISPR/Cas9技术敲除CCR4基因;将不同处理的细胞分为四组:CCL17刺激CCR4+Th2细胞、无CCL17刺激CCR4+Th2细胞、CCL17刺激CCR4-Th2细胞和无CCL17刺激CCR4-Th2细胞。共聚焦显微技术(Confocalmicroscopy,CM)检测了四组细胞CCR4表达情况,明确CCL17刺激Th2细胞表面CCR4是否内化。流式细胞术以及细胞计数试剂盒-8(Cellcountingkit8,CCK8)分别检测四组不同处理过的细胞迁移以及增殖能力。进一步PCR-Array筛查CCL17刺激CCR4+Th2细胞和无CCL17刺激CCR4+Th2细胞之间下游转录组的表达差异。再通过ELISA检测不同处理的四组细胞下游分泌蛋白水平以及免疫印迹法(Western Blot,WB)分析p-ERK、ERK、p-STAT3 和 STAT3 的表达;ERK抑制剂处理 CCL17刺激 CCR4+Th2细胞和无CCL17刺激CCR4+Th2细胞后,ELISA检测细胞下游分泌蛋白水平以及Western Blot分析蛋白表达情况。最后将四组不同处理的细胞分别与角质形成细胞共培养24小时,Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术分析角质形成细胞凋亡情况。3.建立奈韦拉平(Nevirapine,NVP)诱导药疹大鼠模型,通过CCR4拮抗剂(Compound47)和地塞米松(DXM)分别干预药疹大鼠模型,并评估其疗效。分为对照组、未治疗组、治疗组(Compound47组和DXM组)四组。采用HE染色、甲苯胺蓝染色以及Caspase-3染色评估四组大鼠皮肤病理表现、肥大细胞浸润以及角质形成细胞凋亡情况。通过ELISA检测和流式细胞术动态检测四组大鼠外周血中细胞因子水平以及Th2细胞亚群表达情况。最后Western blot检测四组大鼠皮损 p-ERK、ERK、p-STAT6、STAT6、pro-Caspase3 表达情况。[结 果]1.在临床研究中发现CCL17水平在HIV+SDE+患者(n=15)外周血血清中高于HIV+SDE-患者(n=15),在HIV-SDE+患者中(n=10)高于健康者(n=20)(P=0.037,P=0.034)。进一步研究表明HIV+SDE+患者外周血中Th2细胞亚群高于HIV-SDE+患者和HIV+SDE-患者(P=0.002,P=0.010)。IL-4水平在HIV+SDE+患者高于HIV-SDE+患者和HIV+SDE-患者(P=0.034,P=0.023),IL-13水平在HIV-SDE+患者高于健康者(P<0.001)。在SDE患者外周血中分泌CCL17的CD4+T细胞高于健康者(P=0.016)。2.在体外试验中,首先发现CCL17(1000ng/ml)刺激Th2细胞后表面CCR4发生受体内化。进一步CCL17刺激CCR4+Th2细胞分别与无CCL17刺激的CCR4+Th2细胞和CCL17刺激的CCR4-Th2细胞比较,发现CCL17刺激CCR4+Th2细胞的趋化能力增强(P=0.003,P=0.011)。CCL17刺激CCR4+Th2细胞72h后,增殖能力增强(P=0.026,P<0.001)。CCL17刺激CCR4+Th2细胞分泌IL-4和IL-13的水平显著升高(P=0.002,P=0.032)(P=0.012,P=0.019)。CCL17 刺激的 CCR4+Th2 细胞表达蛋白 p-ERK/ERK 和 p-STAT3/STAT3 比值升高(P=0.030,P<0.001)(P=0.043,P<0.0001)。使用 ERK抑制剂的CCL17刺激的CCR4+Th2细胞表达蛋白p-ERK/ERK和p-STAT3/STAT3 比值较 CCL17 刺激的 CCR4+Th2 细胞降低(P<0.0001,P=0.011),IL-4和IL-13分泌降低(P<0.0001,P=0.006)。最后,与无CCL17刺激的CCR4+Th2细胞和CCL17刺激的CCR4-Th2细胞比较,CCL17刺激的CCR4+Th2细胞引起角质形成细胞凋亡率显著增加(P=0.003,P<0.001)。3.在奈韦拉平诱导药疹大鼠模型中,CCR4拮抗剂(Compound47)以及地塞米松(DXM)干预的药疹大鼠皮疹好转,耳红肿消退,体温降低。对比未治疗组,Compound47和DXM治疗均可降低大鼠外周血中Th2细胞亚群(P<0.001,P<0.001),以及降低大鼠皮损中肥大细胞数(P=0.001,P=0.001)。Compound47还可降低药疹大鼠外周血中IL-4、IL-5和IL-13水平(P=0.039,P=0.003,P=0.014)。Compound47和DXM治疗后大鼠皮损中蛋白p-STAT6/STAT6表达降低(P<0.001,P<0.0001)。[结论]CCL17由CD4+T细胞释放后,可能促进Th2细胞表面CCR4内化后通过磷酸化ERK/STAT3信号通路促进Th2细胞趋化、增殖和释放IL-4和IL-13,进一步引起角质形成细胞凋亡。CCR4拮抗剂阻断CCL17/CCR4轴后降低药疹大鼠Th2细胞亚群数、IL-4、IL-13水平及降低皮损肥大细胞浸润,以及抑制角质形成细胞的凋亡(可能依赖磷酸化STAT6信号通路),从而减轻奈韦拉平诱导的药疹大鼠皮疹症状。