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第一部分GSK-3β/β-catenin通路调节正畸牙张力侧的骨形成目的:探究在正畸牙移动过程中GSK-3β/β-catenin信号通路在张力诱发的骨形成中的重要作用。方法:选取来自苏州大学的实验动物研究中心的35只8周雄性大鼠SD大鼠作为研究对象,大鼠重约200-250克,大鼠被分成7组:不加力空白对照组(Control,0d,n=5),牙移动7天组(7d,n=5),牙移动14天组(14d,n=5);磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)正畸牙移动7天组(Orthodontic Tooth Movement,OTM group,n=5),LICL干预的牙移动7天组(OTM+Li Cl group,n=5),ICG-001干预的牙移动7天组(OTM+ICG group,n=5),及Li Cl和ICG-001共同干预的牙移动7天组(OTM+Li Cl+ICG group,n=5)。采用10%水合氯醛按3 mg/ml剂量腹腔注射麻醉大鼠,将0.25mm直径的结扎丝从大鼠左侧上颌第一和第二磨牙之间穿过并拉伸镍钛拉簧,使其产生0.49N的力。Li Cl组及Li Cl+ICG-001组的大鼠按照200 mg/kg/d的剂量胃灌注。ICG-001组每天按照10μg的剂量局部注射于大鼠上颌左侧第一磨牙的近中腭侧牙根的粘骨膜下方直到处死。此外使用LICL灌胃的大鼠每天接受同样剂量的PBS或者ICG001的局部注射(10μg),在正畸力开始应用之前直到处死。然后分别行显微电子计算机断层扫描(Micro Computed Tomography,Micro-CT)、组织学和免疫组织化学分析方法检测。结果:Micro-CT与苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,H&E)染色结果显示,正畸力加载的大鼠在术后14天,第一磨牙和第二磨牙之间的距离明显大于对照组(0 vs 0.24mm,P<0.05);在实验组大鼠中,牙周膜间隙增宽,牙周纤维被拉伸细化,而对照组中没有观察到这些现象;Micro CT显示:张力侧牙槽骨骨参数,如骨密度(Bone Mineral Density,BMD)、骨体积分数(Bone Volume To Tissure Volume Ratio,BV/TV)和骨小梁厚度(Trabecular Thickness,Tb.Th)均有显著增加,而在正畸力作用下,骨小梁间隙(Trabecular Space,Tb.Sp)明显减少;免疫组化结果显示,与对照组相比,作为成骨细胞早期发育和活性的分子标记物碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和成骨锌指结构相关转录因子(Osterix,OSX)阳性细胞在大鼠正畸力加载牙的张力侧牙槽骨内显著增多;正畸牙移动所加载的机械负荷可以显著增加张力侧牙槽骨β-catenin的表达;在正畸牙移动的第7天,张力侧牙槽骨内的phospho-Ser9-GSK-3β的表达水平显著增高,第14天开始下降,但仍高于对照组;然而,机械负荷对大鼠张力侧牙槽骨的GSK-3β表达影响不大。对于经过糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthetase kinase 3β,GSK-3β)抑制剂氯化锂(Lithium chloride,LICL)干预的正畸牙移动7天的大鼠,牙槽骨张力侧感兴趣区域(Region Of interest,ROI)的BMD(132.3 versus 160.8mg/cm3;P<0.01)显著增加,BV/TV和Tb.Th三项指标亦显著升高,但Tb.Sp指标显著降低;免疫组化检测结果显示,与对照组相比,大鼠正畸牙移动张力侧牙槽骨中丝氨酸9位点磷酸化糖原合成酶激酶-3β(phosphoSer9 glycogen synthetase kinase 3β,p-Ser9-GSK-3β)染色信号更强,然而,机械负荷药物干预对大鼠张力侧牙槽骨的GSK-3β表达水平影响不大,正畸牙移动7天的大鼠使用GSK-3β选择性抑制剂灌胃7天后,下调的GSK-3β显著增加了β-catenin的表达。药物干预结果显示,与未经干预的大鼠相比,经过载荷力诱导处理的大鼠,氯化锂可以使phospho-ser9-gsk-3β表达明显增加,在GSK-3β抑制剂干预组中有更多阳性细胞,ALP和Osterix因子阳性细胞显著增多;而经Wnt/β-catenin拮抗剂ICG-001局部注射后,大大削弱了氯化锂对骨量、ALP和Osterix表达的影响。药物毒性检测结果:正畸牙移动药物干预7天时,各组大鼠的血样中谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、尿素氮(usea nitrogen,BUN)、肌酐(creainine,CRE)、尿酸(Uric acid,UA)等生化指标的变化不大,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:GSK-3β/β-catenin信号通路的活性与在正畸牙移动过程中张力侧的牙槽骨形成相关。GSK-3β抑制剂可以加速张力诱导的骨形成,但不影响牙齿移动速度。可见,GSK-3β/β-catenin信号通路被激活后有助于正畸力引起的骨改建,可作为临床治疗的潜在靶点。第二部分GSK3β/β-catenin通路调节正畸牙移动过程中压力侧骨吸收目的:探究在正畸牙移动过程中GSK-3β/β-catenin信号通路在压力侧骨吸收中的重要作用。方法:与第一部分相同。从形态学的角度出发,利用H&E和Micro-CT检测牙槽骨形态及骨量,并通过免疫组化染色分别检测压力侧破骨细胞调节因子基质金属蛋白酶9(Matrix metallopeptidase 9,MMP-9)、核因子κB受体活化因子配体(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL)基因以及GSK-3β/β-catenin通路效应分子GSK-3β、p Ser9-GSK-3β、β-catenin的表达情况。结果:H&E和Micro-CT结果表明,当加载正畸力时,第一磨牙偏离近中移动,与第二磨牙之间的距离越来越大。机械负载诱导的大鼠在术后第14天,第一磨牙和第二磨牙之间的距离明显大于对照组(0 vs 0.18mm,P<0.05)。机械负载压力作用下,移动牙压力侧的牙周膜纤维排列无规则,形态不完整。加力7天时,压力侧牙周间隙明显缩窄,牙槽骨破坏严重,骨质边缘蚕食状不规则吸收,见骨吸收陷窝(Howship陷窝)。而对照组牙周纤维排列规则,宽度均匀,成纤维细胞均匀分布在牙周纤维间,胞浆胞核结构清晰。抗酒石酸酸性磷酸酶染色(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)结果显示染色结果显示,所有组的大鼠移动牙周组织内均可见破骨细胞,0天时可见的破骨细胞较少,随着加力时间的增加,大鼠移动牙压力侧牙槽骨边缘可见多核、红色胞浆,蓝色胞核的破骨细胞,且大多数位于骨吸收陷窝内,破骨细胞的数目随着加力天数的增加而增加:当加力天数为7天时达到最大值,同时可见明显的牙槽骨吸收现象,加力14天时开始破骨细胞数量开始下降。免疫组化染色结果显示,棕黄色的MMP9和RANKL阳性细胞的数量均随着加力天数的增加而增加:当加力0天时,MMP-9和RANKL阳性细胞数量较少,当加力7天后,MMP-9和RANKL阳性细胞数量显著增加,当加力到14天后,MMP-9和RANKL阳性细胞数量明显再次减少,组间差异具有统计学意义(P<0.05);GSK-3β、Phospho-Ser9-GSK-3β、β-catenin、三种阳性细胞的数量随着加力天数变化不同:当加力0天时,压力侧牙槽骨Phospho-Ser9-GSK-3β、β-catenin阳性细胞数量较少;正畸牙加力7天时,Phospho-Ser9-GSK-3β、β-catenin阳性细胞数量上升,表达最多,GSK-3β阳性细胞数量下降,表达最少;加力14天时,与加力7天相比,Phospho-Ser9-GSK-3β、β-catenin阳性细胞数量下降,但比0天时多;整个加力过程中,GSK阳性细胞数量上升或无显著性差异;对于经过GSK-3β抑制剂刺激的大鼠,压力侧BV/TV和Tb.Th两项指标显著减少;TRAP染色显示:所有实验对照组的大鼠被移动牙的压力侧牙周组织内均可见破骨细胞,但各组阳性细胞的数量有所不同,其中OTM+Li Cl组最多;当给压力诱导的大鼠灌胃7天Li Cl时,β-catenin和Phospho-Ser9-GSK-3β阳性细胞的数量增加,GSK-3β阳性细胞的数量减少,GSK-3β/β-catenin信号通路被激活,MMP-9、RANKL细胞数量明显增加;当给压力诱导的大鼠局部注射7天ICG001时,正畸牙移动压力侧牙槽骨的MMP-9、RANKL阳性细胞细胞明显减少,GSK-3β/β-catenin信号通路被抑制,表现为β-catenin和P-GSK阳性细胞的数量减少,GSK-3β阳性细胞的数量增加。当给压力诱导的大鼠进行Li Cl干预的同时局部注射ICG001时,激活的GSK-3β/β-catenin信号通路同时受到抑制,与单纯使用Li Cl干预组相比,β-catenin和P-GSK表达下降,GSK-3β表达上升,MMP-9和RANKL阳性细胞个数减少,骨量增多,但仍多于对照组。结论:在大鼠正畸牙移动过程中,移动牙压力侧破骨细胞的形成与加力时间有关;GSK-3β/β-catenin信号通路参与了正畸牙移动过程,并与正畸牙压力侧骨吸收破骨细胞形成起正调控的作用。第三部分体外实验:机械张力作用下GSK-3β/β-catenin通路调控成骨细胞的形成和分化目的:通过对细胞加力以模拟正畸牙移动的过程。从分子生物学角度探讨影响正畸牙移动中,张力对成骨相关指标的影响和作用机制,为正畸牙移动提供理论参考。方法:本文选取SAOS2细胞作为研究对象进行体外实验,通过对体外培养细胞施加牵引力(0、1、3、6、12小时)模拟机体细胞受力环境,采用ALP试剂盒检测ALP活性,采用蛋白印迹法(Western blot,WB)和实时定量PCR(Realtime-polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测ALP、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)和OSTERIX等蛋白及基因的表达情况,以及GSK-3β、Phospho-Ser9-GSK-3β、β-catenin的表达水平,结合以上的生物学检测探讨影响正畸牙移动过程的成骨分化的相关因子作用及机制。结果:光镜下观察:加力前(0h),细胞多呈现不规则的、单核、圆形或椭圆形状,可见细胞凸起发生,整个胞体均被这些细胞占据,加力后,细胞形状逐渐从类似圆形生长成为纤维状,并且排列具有一定的方向性,并且,随着加力时间的延长,纤维状细胞数量越来越多。经ALP活力测试试剂盒检测发现:ALP的活性随着加力时间的增加而增加,当加力到6h时,ALP的活性显著比对照组高,差异具有统计学意义(P<0.05),实时定量PCR结果显示:ALP和OCN基因随着加力时间的增加而明显增加,当加力时间达到6h时,ALP和OCN均达到最大值,RUNX2在1h与3h表达下降,但6h时显著增加;OSTERIX则随着加力时间的延长而发生先降低后升高的趋势变化,差异具有统计学意义(P<0.05);蛋白印迹法(Western bolt,WB)检测结果显示,应用拉伸幅度15%,加载频率0.5HZ的机械牵张力刺激能有效增加RUNX2和OCN蛋白的表达。与对照组相比,OCN的表达在各加力组1h、3h和6h时间点均有明显增加,差异具有统计学意义(P<0.0.5),而RUNX2的表达与OCN的表达情况不同,RUNX2的表达随着加力时间的增加呈现先增加再降低,然后再增加的趋势,加力组与对照组的RUNX2表达具有明显差异(P<0.0.5),同时,GSK-3B、P-GSK、β-catenin蛋白均随加力时间的增加而数量有所增加,加力6h后蛋白表达达到高峰;ALP活性测试结果还显示成骨细胞+LICL共培养与成骨细胞+LICL+ICG001共培养,加力6h后,其ALP活性变化与对照组相比均有显著的增加,差异具有统计学意义(P<0.05);相比对照组,ICG001干预后,ALP活性有所降低,但差异不显著(P>0.05)。与对照组相比,p Ser9-GSK-3β与GSK-3β的比值以及β-catenin的含量均显著上升,差异具有统计学意义(P<0.05),但当ICG001加入后,p Ser9-GSK-3β与GSK-3β的比值以及β-catenin的含量均显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:体外机械张力影响成骨细胞的形成和分化,其机制与GSK-3β/β-catenin信号通路的调控相关。