目的本研究旨在利用合成模块,建立11C标记GDC-0941作为新型PET分子探针的方法,并通过乳腺癌细胞的体外/内实验,评价11C标记GDC-0941的药代动力学特征,为预测GDC-0941在体内的药效情况提供帮助。材料与方法1.制备标准品:前体GDC-0941购自美国Selleck公司。用强碱Na H(4.5-5.0eq)和CH3I(4.5-5.0eq)进行冷标记,溶剂为四氢呋喃,产物用柱分离,对前体GDC-0941甲基化。2.制备11C-GDC-0941:11C标记GDC-0941由美国GE公司的自动化合成设备TRACERLAB FXC Pro通过一步法合成,产物通过半制备型HPLC分离纯化,纯化后用分析型HPLC测定放化纯。3.不同乳腺癌亚型细胞对[11C]-GDC-0941的摄取实验:PI3K/Akt/m TOR通路的活化与PIK3CA的突变有关,而PIK3CA的突变与PI3Kp110α的蛋白表达量相关,因此选取PI3Kp110α表达不同的两种乳腺癌细胞MCF-7(PI3Kp110α高表达)和MDA-MB-231(PI3Kp110α低表达)培养,并用Western blot对两种细胞该蛋白的表达情况鉴定。测定不同时间点(10、30和60min)上述细胞对[11C]-GDC-0941的摄取率。4.尾静脉注射[11C]-GDC-0941行正常昆明小鼠60min动态显像及上述乳腺癌细胞荷瘤鼠60min静态显像及不同时间点(10、30和60min)的生物分布研究。结果1.用原料GDC-0941进行甲基化反应时,产生了两个异构体,对这两个异构体做了1H-NMR和13C-NMR分析,确定了两个标准品的结构,分别命名为GDCM和GDCI。2.[11C]标记GDC-0941时得到两种同分异构体产物,分别取两种产物进行分析型HPLC与标准品比对,证实为[11C]-GDCM及[11C]-GDCI,因GDCI对两种乳腺癌细胞的半数抑制浓度与原药GDC-0941相近,而GDCM远高于GDC-0941,且GDCI的产率高于GDCM,因此本实验中我们选取[11C]-GDCI作为目标产物。后文中便于描述将[11C]-GDCI描述为[11C]-GDC-0941,其标记率为33.7±9.3%(n=6),比活度52.2±17GBq/μmo L(n=6)。分析型HPLC的结果显示[11C]-GDC-0941的放化纯在10、30、60及90min均大于95%,体外稳定性良好。3.经Western blot及肿瘤组织的免疫组化结果鉴定,MCF-7细胞及肿瘤组织的PI3Kp110α蛋白表达明显高于MDA-MB-231。细胞摄取实验显示MCF-7和MDA-MB-231在10、30及60min的细胞摄取率分别为3.10±0.29%vs.1.42±0.06%(P=0.0001)、3.23±0.15%vs.1.58±0.09%(P<0.0001)、4.32±0.64%vs.2.14±0.10%(P=0.002)。4.Micro-PET动态显像研究显示[11C]-GDC-0941主要经肝脏及肠道排泄,其他组织对该显像剂摄取较少。PET静态显像及生物分布表明在注射显像剂1h后MCF-7荷瘤鼠对[11C]-GDC-0941的摄取最高,肿瘤/肌肉(T/M)为3.22±0.54,而MDA-MB-231肿瘤的T/M仅为1.28±0.30,二者具有显著性差异(P=0.045)。Micro-PET显像显示阻断组MCF-7荷瘤鼠肿瘤未见确切显影。结论我们首次用11C标记PI3K抑制剂GDC-0941,其标记方法简单,作为一种新型分子探针可为了解GDC-0941在体内的药效情况提供帮助。但是在体内分布动力学特性并不十分理想,肝脏和肠道摄取过高,而且11C半衰期过短,不利于更长时间点的显像。因此,改善GDC-0941的水溶性,以及利用半衰期较长的18F进行标记需要进一步研究。目的本研究旨在将三乙二醇(triethylene glycol,HO-PEG3-OH)连接到GDC-0941,并使用半衰期更长的放射性核素18F对其进行标记,制备18F-PEG3-GDC-0941新型分子探针,并通过乳腺癌细胞的体外实验、乳腺癌肿瘤动物模型的在体显像,评价18F-PEG3-GDC-0941的在体药代动力学特征以及肿瘤的摄取。材料与方法1.前体GDC-0941-PEG-OTs的制备、纯化和鉴定:先制备HO-PEGOTs,然后将HO-PEG-OTs与GDC-0941在K2CO3溶液中混合,得到GDC-PEGOH化合物,用硅胶柱分离,得到前体GDC-PEG3-OTs,产物用碳谱和氢谱进行鉴定2.18F-PEG3-GDC-0941的制备:18F标记前体GDC-PEG3-OTs由美国GE公司的自动化合成设备TRACERLAB FX-XN合成,产物18F-PEG3-GDC-0941通过HPLC分离纯化,纯化后测定放化纯。3.不同乳腺癌亚型细胞对[18F]-PEG3-GDC-0941的摄取实验:选取PI3Kp110α表达不同的两种乳腺癌细胞MCF-7(PI3Kp110α高表达)和MDA-MB-231(PI3Kp110α低表达)培养,并用Western blot进行两种细胞该蛋白的表达情况鉴定。测定不同时间点(10、30、60和120min)上述细胞对18F-PEG3-GDC-0941的摄取率。4.尾静脉注射[11C]-GDC-0941行正常昆明小鼠及上述乳腺癌细胞荷瘤鼠Micro-PET 120min动态显像及生物分布研究。结果使用分析型HPLC测定18F-PEG3-GDC-0941的标记率为65.25%±3.85%,比活度为(43.25±1.75)Ci/mmol(n=3)。18F-PEG3-GDC-0941在人血清中的稳定性良好,4小时其放化纯在95%以上。用PEG修饰后,18F-PEG3-GDC-0941的Log P值为1.12±0.01(n=3)。细胞摄取实验显示MCF-7和MDA-MB-231对18FPEG3-GDC-0941的摄取随时间的增加而增加,后者细胞摄取明显低于前者。MCF-7和MDA-MB-231在10、30、60和120min对18F-PEG3-GDC-0941的摄取率分别为2.17±0.23%vs.1.92±0.07%(P=0.11)、2.92±0.29%vs.2.58±0.27%(P=0.13)、3.27±0.07%vs.2.85±0.08%(P=0.000)、3.35±0.08%vs.3.04±0.02%(P=0.003),两种细胞的摄取率在60和120min有显著性差异。4.正常昆明小鼠Micro-PET动态显像研究显示18F-PEG3-GDC-0941仍要经肝脏及肠道排泄,但是肝脏摄取较[11C]-GDC-0941明显降低且排泄速度加快。生物分布结果显示,MCF-7荷瘤鼠在60min时T/M值达到最高为5.76±1.23,而MDA-MB-231荷瘤鼠T/M值为3.00±1.10,二者具有显著性统计学差异(P=0.01)。但是两种荷瘤鼠的血液本底都偏高。结论本研究成功制备了18F-PEG3-GDC-0941,其标记率高、稳定性好,通过连接PEG3增加了探针的水溶性。初步在体研究显示,18F-PEG3-GDC-0941仍主要经肝脏及肠道排泄,但是其肝脏排泄速度明显快于[11C]-GDC-0941,且在PI3Kp110α高表达乳腺癌中有较好摄取。18F-PEG3-GDC-0941是一种有前景的预测GDC-0941疗效的分子探针。但是连接PEG后其血液清除时间延长的问题不可忽视,进一步的研究仍需要进行。目的三阴性乳腺癌是乳腺癌亚型中预后最差的一种类型,其转移发生早,致死率高。尽管其治疗取得了很大进步,但因缺乏有效治疗靶点,患者的总生存率仍较低。本研究旨在探究应用PI3K抑制剂GDC-0941对三阴性乳腺癌的肿瘤抑制作用,并用18F-FDG小动物PET进行疗效观察。方法培养小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞,接种于裸鼠右前肢的外侧皮下(n=20只)。每2天观察一次,用游标卡尺测量并记录肿瘤直径,同时测量记录小鼠体重。GDC-0941溶于0.5%甲基纤维素及0.2%Tween80。每只小鼠按0.1ml/10g的体积给药。肿瘤大小按以下公式计算:肿瘤体积(mm3)=长径×短径2/2。当肿瘤大小长至250 mm3时将小鼠随机分成2组:治疗组(10只),每天口饲GDC-0941(100mg/kg);对照组(10只):每天口饲0.5%甲基纤维素及0.2%Tween80。实验组及对照组均连续给药21天。每组选3只模型鼠进行小动物18F-FDG PET扫描,治疗前(0w)及治疗后(3w)各扫描一次。对其肿瘤组织进行p-Akt(Ser473)免疫组化染色,比较治疗组与对照组p-Akt(Ser473)表达情况。结果PI3K抑制剂GDC-0941对抑制4T1肿瘤生长作用不明显,治疗组与对照组肿瘤大小差异无统计学差异(P=0.117,n=7/组),但是对抑制肿瘤肺转移的作用却十分显著,治疗组和对照组小鼠的肺转移数目分别为(9±3)个和(44±8)个,治疗组明显少于对照组(P=0.002)。另外,治疗3周后18F-FDG显像结果提示治疗组小鼠肿瘤/肌肉值明显低于对照组,分别为4.43±0.27(实验组)和6.65±0.25(对照组),P=0.001(n=3/组)。结论本研究证实了GDC-0941对治疗三阴性乳腺癌有疗效,但是由于PI3K/Akt/m TOR信号通路与其他信号通路存在交互作用,提示联合用药的必要性。18F-FDG对评估GDC-0941的疗效有一定作用,这为进一步应用18F标记GDC-0941对GDC-0941的疗效预测打下坚实的基础。18F-PEG3-GDC-0941有望在GDC-0941的疗效评估中发挥更大的作用。