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褐藻胶是存在于褐藻细胞壁及细胞间质中的一种水溶性酸性多糖,褐藻胶裂解酶通过p-消去反应可将褐藻胶降解为褐藻寡糖,在褐藻寡糖的制备、海藻遗传工程研究及海藻生物质能源开发利用等方面具有重要的应用价值。本文从不同来源样品中筛选得到28株产褐藻胶裂解酶微生物,从中克隆获得26条褐藻胶裂解酶基因片段和4条基因全长,并对其中一株高产褐藻胶裂解酶菌株进行了产酶条件优化和基因克隆表达及重组酶酶学性质研究,具体结果如下:1、从新鲜海带、龙须菜、鲍鱼养殖场、舟山群岛海水等样品中筛选得到28株褐藻胶裂解酶产生菌;细胞形态观察和分子生物学鉴定结果表明,这些产酶微生物主要为交替假单胞菌属、弧菌属、链霉菌属、嗜冷杆菌属等;野生菌的粗酶性质研究显示,筛选得到的褐藻胶裂解酶最适反应pH大多在pH7.0～8.0,最适反应温度在30～50℃之间。2、对一株高产褐藻胶裂解酶菌株Pseudoalteromonassp.BYS-2进行了产酶条件优化,得到的优化产酶方案为:褐藻酸钠1g/L,葡萄糖0.5g/L,酵母膏10g/L,黄豆饼粉3g/L,磷酸氢二铵3g/L,发酵培养基初始pH8.0,接种量2%(v/v),装液量50mL/250mL,摇床转速200r/min,发酵温度20℃,在此条件下发酵24h菌株产酶能力可达5.29U/mL,比优化前(1.57 U/mL)提高了 2.37倍。3、设计简并引物,从交替假单胞菌属中克隆得到26条褐藻胶裂解酶基因片段和4条基因全长(alg390、alg738、alg752、alg1089),其中alg738全长2217bp,编码738个氨基酸,该蛋白的前28个氨基酸为预测信号肽,去除信号肽后的成熟蛋白理论分子量为79.512kDa,等电点为6.28。4、褐藻胶裂解酶基因alg738在Escherichiacoli.BL21(DE)中成功实现了异源表达。重组酶Alg738的酶学性质研究表明:该酶最适反应pH为8.0,最适反应温度45℃,在pH6.0～9.0范围、43℃以下稳定性较好;5mmol/L浓度的Na+、Mg2+、Fe2+、Mn2+对该酶具有明显的促进作用,Ni2、Co2+、Cu2+、Hg2+、Zn2+、EDTA、SDS具有明显的抑制作用;动力学常数Km值、Vmax值分别为1.81mg/mL和0.51μmol/(mg-min);底物特异性分析表明该重组酶为聚甘露糖醛酸偏好性的双功能酶。本文通过从不同环境中筛选产褐藻胶裂解酶微生物,并进行产酶基因调取,对褐藻胶裂解酶产酶菌分别进行了基因克隆表达和产酶条件优化,旨在为寻找新型褐藻胶裂解酶基因及褐藻胶裂解酶的开发应用打下基础。