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抗体作为免疫分析的核心试剂,其制备技术一直是制约免疫分析法在农药残留分析中应用的瓶颈因素,因此寻求一种新的抗体制备方法对农残免疫分析具有重要的意义。本研究利用噬菌体抗体库技术和基因工程技术,制备了拟除虫菊酯单链抗体,并对抗体的结构特点及其与抗原的特异性作用进行了分析。首先,从分泌拟除虫菊酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株2G2E7中提取总RNA,并反转录成cDNA。以cDNA为模板,利用兼并引物进行PCR扩增,获得了长度约350bp的重链可变区基因和约325bp的轻链可变区基因,再经重叠延伸PCR获得了750bp左右的单链抗体(scFv)基因。经过内切酶SfiⅠ和NotⅠ对scFv和pCANTAB5E载体进行酶切、连接和热激法转化大肠杆菌TG1,最终获得了库容大小2.3×107的拟除虫菊酯初级抗体库,阳性率为100%。利用抗原对抗体库进行淘选,通过五轮淘选,有效地富集了拟除虫菊酯特异性噬菌体抗体,第五轮淘选后的噬菌体阳性率为95%；随机挑取五轮淘选后的单克隆进行测序,得到3个scFv基因。将3个基因进行PCR扩增、EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后,与pET-26b载体进行连接,成功构建重组表达载体scFv-pET26b。将重组质粒转入表达菌株BL21,最终得到3个scFv-pET26b重组表达菌株。对表达条件进行优化,经超声破碎及SDS-PAGE检测,结果显示在0.1mM IPTG,200rpm,25℃低温诱导12h条件下,3个scFv蛋白能成功表达,重组蛋白主要以包涵体的形式存在于细胞内,少量以可溶形式存在。利用间接竞争ELISA初步鉴定3个scFv的活性,结果表明：拟除虫菊酯2号单链抗体(PBAscFv2)对氰戊菊酯具有一定的结合活性,10μg/mL标品浓度下抑制率约为20%。序列分析结果显示PBAscFv2蛋白共245个氨基酸,重链123个氨基酸,轻链107个氨基酸,柔性连接肽15个氨基酸；经SOPMA软件分析,PBAscFv2二级结构中含α螺旋21处,p折叠109处,p转角23处,随机卷曲92处；利用CPH models3.2Server对PBAscFv2的空间结构进行模拟,并利用Discovery Studio2.5软件将PBAscFv2与氰戊菊酯分子进行对接,结果显示抗原抗体结合区域由三部分构成：①抗体重链高可变区CDR3区(VH-CDR3)残基Met106、Asp107、Tyr108和Trp109；②轻链框架Ⅲ区(VL-FR3)残基Thr91和Ser92；③轻链高可变区CDR2区(VL-CDR2)残基Ala41、Ser42和Pro43。本研究的开展为拟除虫菊酯类农药基因工程抗体的制备、及其在ELISA检测方法中的应用奠定了基础。