稻瘟病是影响水稻产量和稻米品质的重要病害,目前对于稻瘟病的防治依然以化学防治为主,西南地区是我国稻瘟病的常发区,防治药剂主要有三环唑、稻瘟灵等,药剂的长期使用所带来的抗药性问题给稻瘟病的防治带来了重大隐患。戊唑醇是广谱性的内吸性DMIs类杀菌剂,对于多种真菌的防治都有良好的效果,在我国很多地区开始用于防治稻瘟病,但在西南地区还未广泛使用。本研究拟通过对西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性基线的建立,田间抗性监测,抗性菌株的生物学特性以及抗性分子机理等方面的研究,为该药剂在本地区用于防治稻瘟病提供理论指导。1.西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感基线随机选取分离自西南地区的稻瘟病菌野生菌株150株,通过菌丝生长速率法测定了它们对戊唑醇的敏感性,根据EC50值的分布建立了稻瘟病菌对戊唑醇的敏感基线。结果表明,EC50值的区间为0.0475~0.5996μg/mL,平均值为0.2154±0.1497μg/mL,其中最不敏感菌株的EC50值是最敏感菌株的12.62倍。敏感性频率分布呈连续性单峰曲线,因此本研究以供试菌株的EC50平均值作为西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性基线。同时发现,分离自不同地区的稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性呈现显著性差异:分离自四川绵阳的菌株最敏感,其平均EC50值为0.0872±0.0461μg/mL;贵州六枝特区和四川宣汉的菌株最不敏感,平均EC50值分别为0.4570±0.0855μg/mL和0.4436±0.1289μg/mL;四川绵阳的菌株与四川宣汉的菌株对戊唑醇的敏感性相差5.09倍。2.西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的田间抗性分布使用菌丝生长速率法测定了随机选取的30株稻瘟病菌对戊唑醇的MIC值,并以此作为抗性监测的区分剂量对所有采集分离的菌株进行抗性监测。MIC值分布在1.5~4.0μg/mL之间,最大的MIC值为4.0μg/mL。因此,本研究以4.0μg/mL作为稻瘟病菌对戊唑醇的敏感菌株和抗性菌株的区分剂量。对分离自西南地区的1014株稻瘟病菌的监测结果表明,本地区稻瘟病菌对于戊唑醇主要表现为敏感,仅在重庆涪陵和四川宣汉各有一株病菌表现出低抗。虽然西南地区已经有对戊唑醇产生抗药性的菌株出现,但是抗性较低且频率较低,四川和重庆的的抗性菌株发生频率分别为0.33%和0.21%,因此在制定了合理的与其他药剂混用的策略下可以将戊唑醇作为西南地区进行稻瘟病防治的药剂,但是要做好田间抗性的实时监测工作,以延长药剂的使用寿命。3.稻瘟病菌戊唑醇室内抗性菌株的生物学特性通过稻瘟病菌野生菌株进行室内戊唑醇药剂驯化得到两株中抗菌株PWS2-1和PMY30-1,EC50值分别为2.5736μg/mL和1.7689μg/mL,抗性倍数为25.46和31.26。将其在无药的平板上连续培养8代以后,仍然表现为中抗,因此说明其抗性可以稳定遗传。对它们及其亲本菌株的生物学特性进行研究,结果表明,抗性菌株的生长速率显著低于其亲本菌株,产孢量也低于其亲本菌株,PWS2-1与PMY30-1的离体适合度分别为0.76和0.04,因此抗性菌株的离体适合度低于其亲本菌株。同时在水稻叶片上进行了孢子悬浮液的接种测定其致病性,结果表明,敏感菌株PWS2和PMY30的病斑长度分别为6.5±1.00mm和6.9±2.32mm,而抗性菌株PWS2-1和PMY30-1的病斑长度分别为3.6±0.52mm和5.0±0.90mm,说明抗性菌株的致病性显著低于其亲本菌株。测定其在不同的温度及pH值条件下的生长速率,结果表明,抗性菌株对温度和pH值的适应性与其亲本菌株基本一致。而对于不同作用机制的杀菌剂进行敏感性测定的结果表明,戊唑醇抗性菌株对于DMIs类杀菌剂烯唑醇、苯醚甲环唑存在正交互抗性,对于稻瘟灵、三环唑、稻瘟酰胺、吡唑醚菌酯则没有表现出交互抗性。4.稻瘟病菌对戊唑醇抗性的分子机理用CTAB法提取病原菌的DNA,使用特异性引物Cyp51-ⅠF:5’-ATGGGC CTTCTACAGGACACC-3’/Cyp51-ⅠR:5’-TTAGCGCCTCTCC CAGTAAATT-3’;和Cyp51-ⅡF:5’-CTACGCAGTCTTCGGGCT-3’/Cyp51-ⅡR:5’-ATGGCTTTCTT CTTCCC-3’分别对室内抗性菌株PWS2-1和PMY30-1及其亲本菌株PWS2和PMY30的cyp51-Ⅰ和cyp51-Ⅱ基因进行克隆,测序,比对,探寻抗性菌株的突变位点。结果表明,抗性菌株各自的突变位点并不一致:菌株PWS2-1的cyp51-Ⅰ基因未发生突变,cyp51-Ⅱ基因具有3个突变位点,分别为R163C、F253I和V257A;菌株PMY30-1的cyp51-Ⅰ基因具有1个突变位点,为R23G,而cyp51-Ⅱ基因未发生突变。同时对于抗性菌株PWS2-1和PMY30-1及其亲本菌株PWS2和PMY30的cyp51-Ⅰ和cyp51-Ⅱ基因的表达量进行了荧光定量PCR检测,结果表明,抗性菌株与其亲本菌株的cyp51-Ⅰ基因的表达量的变化趋势并不一致,抗性菌株PWS2-1的表达量较亲本菌株高,而抗性菌株PMY30-1的表达量较亲本菌株低;cyp51-Ⅱ基因的表达量则为抗性菌株明显低于亲本菌株。因此本研究所驯化的抗性菌株的抗性分子机理可能与cyp51基因的点突变有关而与其表达量的关系并不明确,这需要更进一步的实验进行验证。