柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)属小RNA病毒科、肠道病毒属,是引起婴幼儿手足口病(Hand,foot,andmouthdisease,HFMD)的主要病原体之一,在全球范围内曾出现多次大规模爆发流行。CA16感染引起的主要临床症状包括手、足、口部疱疹等,多数病例较轻并具有自限性,但也存在少量个别病例出现无菌性脑膜炎、脑干脑炎、肺水肿和肺出血等重症并导致死亡。疫情的爆发已经成为危害婴幼儿健康的重大社会公共卫生问题,目前临床上仍缺乏防治CA16感染的特效药物和疫苗,因此对于CA16病原学特征的深入研究显得尤为重要。利用反向遗传学技术构建感染性克隆解决了 RNA病毒基因组难以操作的问题,是在cDNA水平上研究RNA病毒的有力工具,能够在体外对病毒基因组进行突变、缺失、嵌合等操作后,由感染性克隆体外转录获得病毒基因组RNA,并转染易感细胞可获得拯救病毒,通过对比这些操作其表型、性状变化的影响,为研究RNA病毒的基因的结构与功能、病毒复制机制和致病机理提供崭新的途径。首先我们构建了 CA16(G20株)基因组全长cDNA感染性克隆。以病毒基因组RNA为模板扩增得到CA16基因组全长cDNA,并将其通过TOPO-TA克隆进入载体。利用T7聚合酶系统以线性化的重组质粒为模板进行体外转录反应得到CA16病毒基因组RNA,并将CA16基因组RNA转染Vero获得拯救病毒,经基因组序列分析、RT-PCR、免疫荧光和透射电镜鉴定,确定拯救病毒为柯萨奇病毒A组16型。CA16拯救病毒的蚀斑形态、体外增殖动力学曲线和乳鼠感染致病特征与其母本CA16野生型病毒基本一致,良好地保留了母本病毒的生物学性状、增殖特性和动物感染与致病特征。在成功构建CA16基因组全长cDNA感染性克隆并获得CA16拯救病毒的研究基础上,我们利用反向遗传学方法将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)EG基因通过融合PCR插入上述CA16病毒的基因组的5’UTR和VP4基因之间中,并在EGFP基因和VP4基因之间引入2A蛋白酶切割位点,成功构建了 EGFP嵌合CA16基因组全长cDNA感染性克隆。经基因组序列分析、RT-PCR、Western blot、免疫荧光和透射电镜鉴定以及体外Real-time PCR、荧光强度观察、荧光定量分析和动物体内组织冰冻切片荧光观察确定,成功获得了一株表达绿色荧光蛋白报告基因的EGFP嵌合CA16拯救病毒。通过荧光显微镜观察EGFP的表达情况就可以直观指示病毒的生长情况。EGFP嵌合CA16拯救病毒的蚀斑形态、体外增殖动力学曲线和乳鼠感染致病特征与其母本CA16野生型病毒基本一致,但通过对感染乳鼠的生存率、相关组织病毒载量和病理改变的分析后发现,EGFP嵌合CA16拯救病毒的乳鼠致病性较CA16野生型病毒略低。综上所述,本研究利用反向遗传学技术,通过构建CA16感染性克隆和EGFP嵌合CA16感染性克隆并获得拯救病毒,为进一步研究CA16病毒基因功能,寻找病毒毒力位点,检测病毒对细胞的感染情况,定位追踪病毒感染途径和部位,深入研究CA16致病机理和CA16抗病毒药物筛选和疫苗研发奠定基础。