蝉棒束孢缺失有性子实体机理的研究

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蝉棒束孢(Isaria cicadae)也称为蝉花(Isaria cicadae Miquel),是一种珍贵的药用真菌,具有明目、解毒、退热及镇惊等功效,同时也是一种广谱的生防真菌,并且具有安全性高、产孢量大以及感染能力强等优势。然而蝉棒束孢仅存在无性繁殖的生殖方式,其有性型子实体并未发现。目前对蝉棒束孢的研究主要集中在有效成分分析以及药理作用研究上,其遗传学方面的研究几近于无,因此蝉棒束孢有性型子实体缺失的现象并没有得到合理的解释。本研究克隆出蝉棒束孢交配型基因MAT1-1-1和MAT1-2-1全序列,并进行生物信息学分析。根据交配型编码蛋白的氨基酸多序列比对结果,在蝉棒束孢序列特异性区域设计并获得交配型鉴定引物,对安徽地区蝉棒束孢种群的交配型进行鉴定。采用对峙培养法以及菌株配对出草实验探究不同交配型菌株间的营养亲和性关系,以期揭示蝉棒束孢有性子实体缺失的原因。主要结果如下:1、利用RACE技术分别从菌株RCEF 6212、RCEF 6213克隆得到MAT1-2-1及MAT1-1-1全长cDNA序列。分析表明,MAT1-1-1 cDNA序列全长为1895bp,开放阅读框为1734bp,编码577个氨基酸。5’-UTR与3’-UTR分别为80个核苷酸和81个核苷酸。编码蛋白分子式为C2828H4398N770O868S29,分子量64kD,理论等电点为5.877,该蛋白含有一个MAT alpha1蛋白保守区域。MAT1-2-1cDNA序列共1290bp,开放阅读框为771bp,编码256个氨基酸。5’-UTR与3’-UTR分别为113个核苷酸和406个核苷酸。编码蛋白分子式为C1294H2085N387O378S13,分子量29kD,理论等电点为9.830,包含一个DNA结合位点及HMG蛋白保守区域,保守域长度88个氨基酸。在两个单基因构建的系统发育树中,蝉棒束孢与细脚棒束孢(Isaria tenuipes)系统发育关系均为最为接近,相似度分别为88%和89%。2、交配型编码蛋白的氨基酸多序列比对表明,蝉棒束孢与其他四种子囊菌如细脚棒束孢、蛹虫草(Cordyceps militaris)、冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)对应的氨基酸序列具有保守氨基酸的一致性与部分氨基酸的相似性。根据蝉棒束孢序列特异性区域设计两对交配型鉴定引物(MAT1-1F/MAT1-1R和MAT1-2F/MAT1-2R),PCR验证结果显示,两对引物可以分别扩增出预期的蝉棒束孢MAT1-1-1与MAT1-2-1片段,且均不能扩增出其余四种子囊菌的交配型基因。3、对安徽地区蝉棒束孢菌株交配型组成和比例进行了研究。结果表明,来自安徽地区的40株蝉棒束孢菌株中存在两种交配型:MAT1-1(14株)或MAT1-2(26株),不存在同时含有两种交配型基因的菌株,即这些菌株的有性生殖方式均为异宗配合。同时,该地区的交配型比例相对均衡,不存在某一种交配型缺失或占绝对优势的现象,因此从交配型的角度可以推测该地区蝉棒束孢具有有性生殖的可能性。4、对已区分交配型的单孢株的营养亲和性关系进行分析。在对峙培养实验中,互补交配型菌株表现为营养不亲和,而同种交配型菌株亦表现为营养不亲和。不亲和反应分为2种形态:I型态表现为抗衡区几乎没有菌丝生长;II型态表现为接触区域由菌丝交织而形成致密并隆起的分界线。在互补交配型菌株配对出草实验中,配对菌株的菌丝量、产孢量以及孢梗束产量均受到明显的抑制,与营养不亲和的形态相吻合。5、综合分析发现,在蝉棒束孢中,互补交配型菌株间的营养不亲和性可能是其有性型子实体缺失的原因。
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