水貂病毒性肠炎是由水貂肠炎细小病毒(Mink enteritis parvovirus, MEV)引起的,以剧烈腹泻为主要临床特症的急性、传染性疫病,该病传播速度快,幼貂致死率达80%,常对养貂业造成巨大的经济损失。MEV作为猫细小病毒(Feline parvovirus, FPV)的变种,属于细小病毒科,细小病毒属成员,基因组为单股负链DNA,包含两个ORF,左端ORF编码非结构蛋白NS1和NS2,右端ORF编码结构蛋白VPl和VP2。NS1蛋白是多功能蛋白,调控病毒基因组复制和转录。VP2蛋白是主要的衣壳蛋白,含有关键功能位点,参与调控病毒复制、血凝性、抗原性、宿主范围和致病性；VP2蛋白还能自我组装形成空衣壳。本课题主要对MEV VP2蛋白中参与调控病毒复制和宿主范围的关键氨基酸位点进行研究。首先,从发病水貂粪便样品中分离出一株MEV毒株,通过PCR鉴定、F81细胞分离培养、电镜观察、血凝和血凝抑制、间接免疫荧光(IFA)和动物感染等实验方法,证明分离株为一株MEV致病株,命名为MEV-LHV。IFA结果表明,致病株MEV-LHV的感染效率比本实验室已分离的弱毒株MEV-L高。MEV-LHV和MEV-L的多步生长曲线结果表明,致病株MEV-LHV具有更强的复制能力,其最高滴度是弱毒株MEV-L的10倍。PCR扩增获得了包括两端发夹结构序列的MEV-LHV全基因组序列,并对发夹结构及其功能元件进行了预测。将MEV-LHV和MEV-L的全基因组序列与GenBank上的其它6株全基因组序列进行了同源比对分析和进化树分析,更全面的了解了MEV全基因组特征和进化特性,推测了可能与病毒复制和致病性相关的位点。上述研究中发现致病株比弱毒株具有更高的复制能力和致病性。为了探究VP2蛋白上可能与病毒复制和致病性有关的氨基酸,对GenBank中20株MEV毒株(包括MEV-LHV和MEV-L)的VP2序列进行了分析,发现强弱毒株间有3个氨基酸位点存在差异,即101、232和411。以本实验室已构建的MEV-L全基因组感染性克隆pMEV-L为模板,利用PCR介导的定点突变技术,分别将101 Ile、232 Ile和411 Ala突变成强毒株的相应氨基酸101 Thr、232 Val和411 Glu,除了3个单位点突变的感染性克隆,还构建了3个位点都突变的感染性克隆。共4个全基因组感染性克隆转染F81细胞,经细胞病变、IFA等鉴定,证实4个突变体病毒拯救成功。各位点突变不影响病毒对宿主细胞的结合及进入能力。病毒VP2基因转录和蛋白表达水平、多步生长曲线、蚀斑实验和单次感染周期内病毒基因组DNA复制的检测等结果表明,101和411位氨基酸突变能够提高病毒的复制效率,但依然比致病株MEV-LHV的复制效率低；232位氨基酸的突变则降低了病毒的转录和复制效率,三突变体病毒(MEV-L I101T/I232V/A411E)的转录和复制水平最低；MEV-LHV与MEV-L转录水平无差异,但MEV-LHV的VP2蛋白表达水平更高,具有更高效的复制效率。对感染性病毒粒子的产生进行检测,结果表明,与亲本毒MEV-L相比,MEV-L I101T和MEV-L A411E不影响感染性病毒粒子的产生；而232位突变(MEV-L I232V和MEV-L I101T/I232V/A411E)则降低了感染性病毒粒子的产生；致病株MEV-LHV产生较高滴度的感染性病毒粒子。突变毒株分别接种水貂,并未产生明显临床症状,结果表明,这3个位点并不是致病力的决定因子。病毒与宿主细胞的识别与结合对病毒的致病性发挥关键作用。MEV不能感染犬肾细胞MDCK,而能感染表达猫源转铁蛋白受体(TfR)的MDCK细胞,证明MEV可以利用猫TfR作为受体感染细胞。MEV和犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)是FPV的宿主变异株,对两者的VP2蛋白氨基酸序列进行比对分析,发现6个差异的氨基酸位点80、93、103、323、564、568。将MEV-L的这6个氨基酸突变成CPV的相应氨基酸,构建了6个单位点突变的感染性克隆,以及93、323同时突变和80、564和568同时突变的2个感染性克隆。将上述8个感染性克隆分别转染F81细胞,经细胞病变、IFA等鉴定,证实8个突变体病毒拯救成功。将MEV 93 Lys和323Asp分别突变成CPV的93 Asn和323 Asn,能够使MEV感染MDCK,两位点同时突变则感染效率更高,证明了93、323位氨基酸突变可使其宿主范围扩大至犬细胞,且其突变不影响病毒与F81细胞受体的结合及细胞内病毒的复制能力。将MEV80Lys、564 Asn和568 Ala分别突变为CPV的80Arg、564 Ser和568 Gly,不影响病毒与细胞的结合能力,但3位点同时突变,则降低了病毒与F81细胞的结合效率,说明80、564、568位氨基酸同时突变,在一定程度上影响了病毒与宿主细胞受体的相互作用,但并不能抑制病毒感染F81细胞。80、564和568位氨基酸的单突变体或三突变体病毒均降低了病毒的复制效率。MEV V103A氨基酸突变对病毒的宿主范围和复制效率无显著影响。目前,随着新的细小病毒的发现,细小病毒宿主范围不断扩大。以上结果将有利于更全面的了解病毒的全基因组特征和生物学特征,为病毒复制、宿主范围和致病性的深入研究奠定基础。