目的:沙门菌作为一种肠道致病菌,可因人或动物食用不洁的水或食物引起感染,严重者甚至致死。在大多数致病性沙门菌中,均含有一段沙门菌质粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence,spv)序列,其中spvB所编码的蛋白在细菌致病过程中发挥重要作用。中性粒细胞作为外周血白细胞中最多且最早到达感染部位的细胞,发挥吞噬清除、释放细胞因子和形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular trap,NET)等功能。NETs是一种由中性粒细胞释放的以DNA为基本骨架、上面缠绕有多种蛋白酶的网状结构。为探究沙门菌感染时沙门菌质粒毒力基因spvB与中性粒细胞NETs在抗感染免疫中的相互作用,本研究第一部分用携带 spvB基因的鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium,STM)标准株野生型SL1344和spvB基因敲除突变株SL1344-⊿pvB,感染仅有固有免疫的斑马鱼幼鱼,观察spvB对斑马鱼幼鱼体内胞外诱捕网(extracellualr trap,ET)和NETs生成的影响;第二部分用SL1344,SL1344-⊿spvB和spvB基因回补株SL1344-c-spvB与中性粒细胞共培养,用细胞模型探究spvB对中性粒细胞NETs生成的影响及其分子机制,为阐明沙门菌质粒毒力基因spvB的致病机制及中性粒细胞在抗感染免疫中的作用提供理论和实验依据。方法:一、观察spvB对斑马鱼幼鱼ETs和NETs生成的影响1.spvB对斑马鱼幼鱼ETs生成的影响109 CFU/ml SL1344 和 SL1344-⊿spvB 浸染法感染受精后 5 d(days post fertilization,dpf)的斑马鱼幼鱼,于感染后6h、8h和10 h收样,用蛋白质印迹法(Western Blot)检测斑马鱼幼鱼体内ETs相关蛋白瓜氨酸化组蛋白3(citrullinated histone 3,CitH3)和肽基精氨酸脱氨酶-4(peptidyl arginine deiminase-4,PAD4)的表达水平。2.红色荧光菌的构建用电转化法将表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的质粒分别转入SL1344和SL1344-⊿spvB中,在含氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)的平板进行筛选,所得菌株在荧光显微镜下观察并用聚合酶链式反应(ploymerase chain reaction,PCR)进行扩增验证。3.spvB对斑马鱼幼鱼NETs生成的影响109 CFU/ml 表达 RFP 的 RFP-SL1344 和 RFP-SL1344-⊿spvB 浸染法感染中性粒细胞表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的5 dpf转基因斑马鱼Tg(lyz:GFP),在收集标本前30 min加入SYTOX Blue核酸荧光染料,于感染后8 h收集斑马鱼幼鱼,用细胞成像仪观察斑马鱼幼鱼体内NETs生成情况。二、spvB对中性粒细胞NETs生成的影响及其分子机制1.中性粒细胞感染模型的构建在稳定增殖的人早幼粒细胞HL-60细胞培养基中加入1.25%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),分别于诱导后6 d、7 d和8 d用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测诱导分化细胞(differentiated HL-60,dHL-60)上 CD11b 的表达,并用瑞氏-姬姆萨法染色后在光镜下观察细胞形态。将 SL1344 分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)5:1、10:1 和 20:1与dHL-60共培养4 h,甲醛固定后瑞氏-姬姆萨法染色光镜下观察细胞形态。根据实验结果,将SL1344以MOI 10:1与dHL-60共培养1 h、2 h、4 h、6 h和8 h后收集细胞,Western Blot检测NETs相关蛋白CitH3的表达。2.spvB对中性粒细胞NETs生成的影响用 SL1344、SL1344-⊿spvB 和 SL1344-c-spvB以MOI 10:1 与 dHL-60 共培养 2 h,分别加入70 U/ml脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase)处理15 min,用SYTOX Green核酸荧光染料染色后在荧光显微镜下观察胞外DNA结构的生成情况。上述菌株以MOI 10:1与dHL-60共培养1 h、2 h和4 h后收集细胞和上清,Western Blot 检测 NETs 相关蛋白髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、CitH3和PAD4的表达水平;PicogreendsDNA定量法检测上清中双链DNA(double-strand DNA,dsDNA)含量。3.spvB影响中性粒细胞NETs生成的分子机制用 SL1344、SL1344-⊿spvB和 SL1344-c-spvB 以 MOI 10:1 与 dHL-60 共培养 1 h、2 h和4 h后,Western Blot检测细胞中蛋白激酶C磷酸化(phosphorylation protein kinase C,p-PKC)水平。分别用1 μM、2μM、5 μM、10 μM和20μM PKC抑制剂白屈菜红碱(chelerythrine,CI)预处理dHL-60细胞30 min,并设CI未处理组作为对照。将SL1344以MOI 10:1与CI处理组和未处理组共培养2 h后收集细胞,Western Blot检测p-PKC和NETs相关蛋白PAD4的表达水平。用20 μM的PKC抑制剂CI预处理dHL-60细胞30 min,将SL1344、SL1344-⊿spvB和SL1344-c-spvB以MOI 10:1分别与CI处理组及未处理组共培养2 h,收集上清和细胞,SYTOX Blue核酸荧光染料染色后荧光显微镜下观察胞外DNA结构的生成情况;Western Blot检测p-PKC水平及NETs相关蛋白MPO、PAD4和CitH3的表达;Picogreen dsDNA定量法检测上清中dsDNA的含量。结果:一、观察spvB对斑马鱼幼鱼ETs和NETs生成的影响1.spvB对斑马鱼幼鱼ETs生成的影响109 CFU/ml SL1344 和 SL1344-⊿spvB 浸染法感染 5 dpf 斑马鱼幼鱼,Western Blot检测ETs相关蛋白CitH3和PAD4的表达水平。结果显示在感染后6 h、8 h和10 h,SL1344-⊿spvB感染组CitH3表达水平高于SL1344感染组(P<0.05);在感染后6 h和8 h,SL1344-⊿spvB感染组PAD4表达水平高于SL1344感染组(P<0.05),在感染后10h,两感染组间PAD4的表达水平无统计学差异。以上结果说明spvB能抑制斑马鱼幼鱼ETs的生成。2.红色荧光菌的构建将表达RFP的质粒用电转化法导入SL1344和SL1344-⊿spvB后,在含Amp的平板筛选出菌落,所得菌落在荧光显微镜下观察发红色荧光;对spvB、spvC和rfp基因片段用PCR进行验证,结果显示RFP-SL1344含有spvB基因片段,RFP-SL1344-⊿spvB 没有spvB基因片段,RFP-SL1344 和 RFP-SL1344-⊿spvB 均含有spvC和rfp基因片段。3.spvB对斑马鱼幼鱼NETs生成的影响109 CFU/ml RFP-SL1344和RFP-SL1344-⊿spvB浸染法感染中性粒细胞表达GFP的5 dpf转基因斑马鱼幼鱼Tg(lyz:GFP),通过细胞成像仪观察SYTOX Blue核酸荧光染料染色后其与斑马鱼幼鱼体内绿色的中性粒细胞和红色的沙门菌的重合情况,判断斑马鱼体内NETs生成情况。结果显示RFP-SL1344感染组和RFP-SL1344-⊿spvB感染组斑马鱼幼鱼体内均有NETs结构形成,即绿色的网状中性粒细胞、红色的荧光菌与胞外DNA蓝色荧光重合部分,且RFP-SL1344-⊿spvB感染组中NETs结构多于RFP-SL1344感染组。以上结果说明spvB能够抑制斑马鱼幼鱼体内NETs生成。二、spvB对中性粒细胞NETs生成的影响及其分子机制1.中性粒细胞感染模型的构建HL-60细胞经1.25%DMSO诱导分化6 d、7 d和8 d后,FCM检测细胞上CD1 lb的表达结果显示,诱导后7 d时细胞上CDllb表达量最高,达80%以上,且此时瑞氏-姬姆萨法染色可见细胞呈典型中性粒细胞形态,可用于后续实验。将SL1344与dHL-60以MOI 5:1、10:1和20:1共培养4h后,瑞氏-姬姆萨法染色结果显示,各组细胞均有细菌进入,MOI为5:1时细胞形态完整,与未感染组无显著差异;10:1时仅有极少数细胞出现胞质松散现象;20:1时部分细胞出现明显破坏。综合以上结果,以MOI10:1作为适宜比例用于后续实验。将SL1344以 MOI 10:1 与 dHL-60 共培养 1 h、2 h、4 h、6 h 和 8 h 后,Western Blot 检测结果显示,各时间点SL1344感染组CitH3的表达水平高于未感染组(P<0.05);感染4h后的各时间点之间差异不显著,故后续实验选择检测时间为感染后1 h、2 h 和 4 h。2.spvB对中性粒细胞NETs生成的影响将 SL1344、SL1344-⊿spvB 和SL1344-c-spvB以MOI 10:1 与 dHL-60 共培养 2 h,用70 U/ml DNase处理后SYTOX Green核酸荧光染料染色。荧光显微镜下显示,DNase未处理时SL1344-⊿spvB感染组胞外DNA网状结构显著多于SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组;DNase处理后三个感染组的胞外DNA结构均消失。上述菌株以MOI 10:1与dHL-60共培养1 h、2 h和4 h后,Western Blot检测NETs相关蛋白MPO、CitH3和PAD4的表达。结果显示,感染后1 h、2h和4h,SL1344-⊿spvB感染组MPO、CitH3和PAD4的表达水平均高于SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组(P<0.05);Picogreen dsDNA 定量法检测上清 dsDNA 结果显示,感染后1 h和2h,SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组的上清中dsDNA均低于SL1344-⊿spvB感染组(P<0.05),感染后4 h三感染组间上清中dsDNA的含量无统计学差异。以上结果说明spvB能够抑制中性粒细胞NETs的生成。3.spvB影响中性粒细胞NETs生成的分子机制将 SL1344、SL1344-⊿spvB 和 SL1344-c-spvB 以 MOI 10:1 与 dHL-60 共培养 1 h、2h和4h后,Western Blot检测p-PKC表达水平。结果显示,在感染后1h和2 h,SL1344-⊿spvB感染组p-PKC的表达水平均高于SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组(P<0.05),感染后4 h三感染组间p-PKC的表达水平无统计学差异。将PKC抑制剂CI按浓度1μM、2 μM、5 μM、10 μM和20μM预处理dHL-60细胞30 min后,SL1344以MOI 10:1与细胞共培养2 h,并设CI未处理组作为对照,Western Blot检测p-PKC和PAD4表达水平。结果显示,CI浓度为20 μM时p-PKC表达水平显著低于CI未处理组(P<0.001);CI浓度为5 μM、10μM和20 μM时,PAD4表达水平显著低于CI未处理组(P<0.001)。综合以上结果,选择PKC抑制剂CI浓度为20μM用于后续实验。用PKC抑制剂CI预处理dHL-60细胞30 10 min后,与SL1344、SL1344-⊿spvB和SL1344-c-spvB以MOI 10:1共培养2 h,并设CI未处理组作为对照。荧光显微镜观察结果显示,CI预处理后三感染组胞外DNA网状结构消失;CI未处理的三感染组均有胞外DNA网状结构,SL1344-⊿spvB感染组的胞外DNA网状结构明显多于SL1344和SL1344-c-spvB感染组。Western Blot结果显示,CI预处理组p-PKC、MPO、CitH3和PAD4的表达水平均显著低于CI未处理组(P<0.001);Picogreen dsDNA定量法检测上清dsDNA结果显示,CI预处理组上清dsDNA含量明显低于CI未处理组(P<0.01)。以上结果表明spvB可通过抑制PKC的磷酸化下调PAD4的表达抑制NETs的生成。结论:1.在斑马鱼幼鱼体内,沙门菌质粒毒力基因spvB可抑制ETs和NETs的生成。2.在中性粒细胞感染模型中,沙门菌质粒毒力基因spvB可抑制中性粒细胞NETs的生成。3.沙门菌质粒毒力基因spvB可通过抑制PKC的活化,下调PAD4的表达从而抑制中性粒细胞NETs的生成。