食管癌是常见的消化道恶性肿瘤。由于早期诊断率低,大部分患者就诊时已是晚期,失去了手术机会。以化疗为主的综合治疗成为中晚期食管癌患者的主要治疗手段。但化疗选择性差,在杀伤肿瘤细胞同时也损伤了正常细胞,其严重的不良反应和肿瘤对化疗药物的抵抗常使临床治疗无法取得满意的疗效。　　 寻找肿瘤发展过程中的有效靶点,研制有效的靶向治疗药物,抑制肿瘤生长,促使肿瘤消退,是近些年来肿瘤研究的热点。靶向治疗不仅可以有效地在分子水平上阻断肿瘤生长的信号通路,还可以避免化疗引起的不良反应,为攻克肿瘤这一难治疾病带来了希望。　　 胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)是一种跨膜的具有酪氨酸激酶活性的蛋白受体。当IGF-1R与配体IGF-1或IGF-2结合后,其酪氨酸激酶活性被激活,启动了特定的信号转导通路,并进一步发挥促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、诱导细胞向恶性表型转化等生物学作用。在乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤组织中,IGF-1R的表达均显著高于相应的正常组织。越来越多的证据表明:IGF-1R所介导的信号转导通路与恶性肿瘤的发生发展有着密切的关系。　　 我们应用Western blot免疫印迹检测Eca-9706、Eca-109和NEC三种食管鳞癌细胞株IGF-1R的表达情况,应用免疫组织化学检测食管鳞癌组织和正常食管上皮组织中IGF-1R的表达,并分析其表达与患者临床特征的关系。　　 siRNA技术是近年来发展起来的一种较新的分子生物学技术。其原理是将外源双链RNA与靶mRNA互补配对结合,切割并降解mRNA,降低靶蛋白的表达,致使转录后基因沉默。siRNA技术具有高度的特异性、有效性和安全性,成为研究基因在肿瘤中的作用的良好工具。　　 我们应用siRNA技术,将携带有IGF-1R特异性序列的真核表达载体pGCsilencerTMU6／Neo／GFP／RNAi-IGF-1R转染食管癌细胞,观察下调IGF-1R表达对食管癌细胞生长增殖能力、克隆形成能力、裸鼠体内致瘤能力和对化疗药物敏感性的影响,探讨IGF-1R在食管鳞癌发生发展过程中的作用,为食管癌靶向治疗提供一个有效的靶点。　　 IGFBP-3通过与IGF-1结合,阻止了其与受体IGF-1R的结合,从而抑制了IGF-1的生物学作用。而且,IGFBP-3还具有不依赖于IGF—1独立的抑制细胞生长和诱导细胞凋亡的作用。人体循环中IGF-1水平增高将导致患多种恶性肿瘤的风险增高,相反,循环中IGFBP-3水平升高将使患肿瘤的风险降低。　　 我们应用酶联免疫吸附试验检测172例食管癌患者化疗前后血清中IGF-1和IGFBP-3的含量。观察化疗前后血清中IGF-1和IGFBP-3的含量的变化,并将化疗前IGF—1和IGFBP-3的含量与化疗疗效之间的关系进行分析,为预测和评价化疗疗效提供一个参考指标。　　 本研究共分以下三个部分:　　 第一部分 IGF-1R在食管鳞癌细胞和组织中的表达　　 方法：　　 1.Western blot免疫印迹检测食管癌Eca-9706、Eca-109和NEC三种食管鳞癌细胞株IGF-1R蛋白的表达情况。　　 2.免疫组织化学检测食管鳞癌组织和正常食管上皮IGF-1R的表达情况。　　 3.分析食管癌组织中IGF-1R的表达与患者临床特征的关系。　　 4.统计分析:应用SPSS13.0软件分析数据,分类变量之间的比较采用x2检验,以α=0.05为显著性检验标准。　　 结果：　　 1.三种食管癌细胞系中均有IGF-1R蛋白的表达,其中食管癌Eca-9706细胞表达水平较高,NEC细胞表达水平较低。　　 2.经免疫组化检测,IGF-1R阳性部位位于细胞膜。80例食管鳞癌组织中11例为阴性,28例呈弱阳性,41例呈强阳性,总阳性率为86.25％,强阳性率为51.25％；18例正常组织中7例为阴性,9例为弱阳性,2例为强阳性,总阳性率为61.11％,强阳性率为11.11％。食管鳞癌组织中IGF-1R表达的总阳性率和强阳性率均高于正常食管组织,有统计学意义(总阳性率x2=4.630,P<0.05；强阳性率x2=9.614,P<0.01)。　　 3.不同年龄组和不同性别组IGF-1R的表达无明显差异(P>0.05)。　　 4.有淋巴结转移患者食管癌组织中IGF-1R表达的总阳性率和强阳性率均高于无淋巴结转移患者(P<0.01)；不同分化程度的组织中IGF-1R表达情况为:低分化组>中等分化组>高分化组。三组间差异均有统计学意义(P<0.05)；临床分期较晚(Ⅲ-Ⅳ期)的患者食管癌组织中IGF-1R表达的总阳性率和强阳性率均高于临床分期较早(Ⅰ—Ⅱ期)的患者(P<0.01)。　　 第二部分下调IGF-1R表达对食管鳞癌细胞生物学行为的影响　　 方法：　　 1.将携带有IGF-1R特异性序列的真核表达载体pGCsilencerTMU6／Neo／GFP／RNAi-IGF-1R转染食管癌Eca-9706细胞,空质粒转染细胞作为对照。　　 2.Western-blot和RT-PCR检测转染后细胞IGF-1R蛋白和mRNA的表达情况。　　 3.细胞计数法和MTT法检测下调IGF-1R表达对细胞增殖能力的影响。　　 4.MTT实验检测下调IGF-1R表达后,食管鳞癌Eca-9706细胞对化疗药物.5-Fu和顺铂的敏感性的改变。　　 5.流式细胞仪检测下调IGF-1R表达对食管癌细胞周期和凋亡的影响。　　 6.平板克隆形成实验检测下调IGF-1R表达对食管癌细胞克隆形成能力的影响。　　 7.分别将未转然细胞、转染空质粒细胞和转染真核表达载体的细胞接种裸鼠,观察裸鼠成瘤情况。连续观察5周后,处死裸鼠,称取瘤重,计算抑瘤率。　　 8.统计学分析:应用SPSS13.0软件分析数据。统计学数据用均数±标准差((x)±s)表示,两样本均数比较采用独立样本t检验,多个样本均数比较采用单因素方差分析。以α=0.05为显著性检验标准。　　 结果　　 1.pGCsilencerTMU6／Neo／GFP／RNAi-IGF-1R转染细胞后,荧光倒置显微镜下可观察到绿色荧光蛋白。经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。　　 2.pGCsilencerTMU6-IGF-1R转染食管癌细胞后,IGF-1R蛋白和mRNA的表达较转染空质粒细胞和未转然细胞明显降低(P<0.05)。　　 3.转染pGCsilencerTMU6-IGF-1R的细胞与转染空质粒细胞和未转然细胞比较,增殖缓慢,倍增时间延长。转染pGCsilenceTMU6-IGF-1R的细胞培养48h后细胞生长抑制率为17.34％,高于转染空质粒细胞(抑制率2.66％)(P<0.01)。　　 4.化疗药物5-Fu和顺铂对转染pGCsilencerTMU6-IGF-1R的食管癌细胞的抑制率高于对转染空质粒细胞和未转然细胞的抑制率(P<0.05)。　　 5.转染pGCsilencerTMU6-IGF-1R的细胞与转染空质粒细胞和未转染细胞比较,G1期细胞百分数增高(P<0.05),S期细胞百分数降低(P<0.01),细胞凋亡率增高(P<0.05),克隆形成能力减弱(P<0.05)。　　 6.接种转染pGCsilencerTMU6-IGF-1R细胞的裸鼠第10-11天可观察到皮下小结节,第14d、21d、28d和35d瘤体大小分别为57.1±19.1mm3、267.0±99.4mm3、482.3±274.9mm3和1006.4±579.8mm3；接种转染空质粒细胞的裸鼠第10-11天可观察到皮下小结节,相应时间点瘤体大小分别为61.5±24.2mm3、365.3±174.3mm3、632.9±306.7mm3和1799.3±658.1mm3；接种未转然细胞的裸鼠第8-9天可观察到皮下小结节,相应时间点瘤体大小分别为89.7±36.3mm3、446.4±240.7mm3、932.9±262.3mm3和2160.4±693.9mm3。三组裸鼠第28d和第35d的肿瘤体积大小之间的差异均有统计学意义(P<0.05)。　　 7.接种转染pGCsilencerTMU6i-IGF-1R细胞组裸鼠瘤重590.6±233.4mg；接种转染空质粒载体细胞组裸鼠瘤重812.3±121.8mg；接种未转染细胞组裸鼠瘤重1236.8±152.5mg。接种转染pGCsilencerTMU6i-IGF-1R细胞组裸鼠和接种空质粒细胞组裸鼠的抑瘤率分别为52.25％和34.32％。三组裸鼠瘤重比较均有统计学差异(P<0.05)。　　 第三部分食管癌患者血清中IGF-1、IGFBP-3与化疗疗效的关系　　 方法　　 1.患者于第一周期化疗前1～3天抽取静脉血2ml,化疗结束后(至少两个周期)第二天抽取静脉血2ml。抽取的静脉血放置4h后,离心机2000转／分,离心10分钟,取上层血清于冻存管中,-40℃保存。　　 2.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测患者化疗前后血清中IGF-1和IGFBP-3的含量。　　 3.观察化疗前后IGF-1、IGFBP-3、IGF-1／IGFBP-3比值的变化,并分析其与化疗疗效的关系。　　 4.根据化疗前IGF-1和IGFBP-3的四分位值,将患者分为1-4四组,分析比较各组的化疗有效率。　　 5.统计分析:应用SPSS13.0统计软件进行统计分析。化疗前后IGF-1、IGFBP-3和IGF-1／IGFBP-3比值的比较采用独立样本t检验。根据化疗前IGF-1和IGFBP-3四分位值分组,各组间有效率的比较采用x2检验。以α=0.05为检验显著性标准。　　 结果　　 1.患者总体化疗前血清中IGF-1的含量为268.87±61.66ng／ml,化疗后IGF-1的含量为266.42±49.98 ng／ml,两者比较无明显差异(P>0.05)。患者总体化疗前血清IGFBP-3的含量为2523.2±469.83ng／ml,化疗后IGFBP-3的含量为2598.8±563.56 ng／ml,两者比较无明显差异(P>0.05)。　　 2.IGF-1在化疗有效组和无效组患者化疗前后均无显著性差异(P>0.05)；IGFBP-3在化疗有效组患者化疗后较化疗前升高(P<0.01),无效组患者化疗前后无显著性差异(P>0.05)。IGF-1／IGFBP-3比值在化疗有效组患者化疗后下降,而化疗无效组患者化疗后升高,均有统计学意义(P<0.05)。　　 3.根据IGF-1四分位值,由低到高分组,第1～4组有效率分别为34.09％、40.48％、67.44％、67.44％。血清中IGF-1水平越高的组,化疗有效率也越高。第3、4两组有效率相同,高于第2组和第1组,均有统计学意义(P<0.05)。　　 4.根据IGFBP-3四分位值,由低到高分组,第1～4组有效率分别为37.21％、46.51％、54.76％、73.81％。IGFBP-3水平越高的组,化疗有效率也越高。第4组有效率高于其它三组,均有统计学意义(P<0.05)。　　 结论　　 1.IGF-1R在食管鳞癌Eca-9706细胞、Eca-109细胞和NEC细胞三种细胞系中均有不同程度的表达。　　 2.食管鳞癌组织中IGF-1R的表达高于正常食管组织。　　 3.IGF-1R的表达与患者年龄、性别无关,与淋巴结转移情况、组织学分级和临床分期有关。有淋巴结转移患者食管癌组织中IGF-1R的表达高于无淋巴结转移患者；随着组织分化程度的降低,IGF-1R的表达增高；临床分期较晚的患者食管癌组织中IGF-1R的表达高于临床分期较早的患者。　　 4.下调IGF-1R表达使食管鳞癌细胞S期细胞百分数下降,G1期细胞百分数增多,细胞凋亡增加。　　 5.下调IGF-1R表达使食管鳞癌细胞生长增殖能力和克隆形成能力减弱,对化疗药物5-Fu和顺铂的敏感性增强,细胞在裸鼠体内成瘤能力减弱,肿瘤生长缓慢。这些结果预示着IGF-1R在食管鳞癌发生发展中发挥着重要作用。　　 6.化疗前后血清中IGF-1／IGFBP-3比值能够较好的反映食管癌患者的化疗疗效。若化疗效果好则IGF-1／IGFBP-3比值下降；若化疗效果差,则IGF-1／IGFBP-3的比值上升。　　 7.血清中IGF-1和IGFBP-3水平高的患者有较高的化疗有效率。血清中IGF-1和IGFBP-3水平可作为预测食管癌化疗疗效的参考指标。