背景：虽然桥接法修复长段神经缺损的标准做法是神经移植，但自体神经移植可供桥接长段神经缺损的供区有限，是一种创伤修复创伤，限制了临床应用。为了克服这一缺点，一直在继续研究寻找更易接受的替代物。目前的研究认为神经缺损的替代材料有：非生物材料PLA、PGA、PPE；生物材料：血管、膜管、变性肌肉、AECM；自体神经移植：游离移植、带血管蒂移植；组织工程：人工神经。AECM抗原性低，且具备接近人体的网架结构、良好的生物相容性、生物力学性能；FN，LN能较完整保留在细胞外基质内，其表面具备细胞膜受体识别位点，有助于促进与雪旺细胞黏附和神经轴突生长，因而是组织工程化人工神经的理想支架。但应用AECM修复缺损的距离受限制，组织工程学研究为解决周围神经修复难题带来新的希望。 目的：本研究采用组织工程化技术制备的脱细胞细胞外基质并行端侧吻合法预构建桥接物修复长段神经缺损，并且雪旺细胞复合脱细胞细胞外基质并行端侧吻合法预构建桥接物修复长段神经缺损，对桥接长段神经缺损的效果做了初步探索，旨在开发自体神经移植的理想替代材料。为组织工程人工神经的临床应用提供理论依据。 方法： 第一部分：组织工程化神经桥接物制备(化学萃取法)；脱细胞细胞外基质结构，活性检测：HE染色光镜组织学观察；Laminin，Febronectin蛋白免疫组化染色；SEM观察拍照；组织相容性研究：AECM皮下包埋试验；AECM材料及预构建材料桥接修复坐骨神经节段性缺损：通过一般观察，组织形态学，HRP示踪试验，RT-PCR等方面对大鼠坐骨神经再生情况进行评估。 第二部分：：将培养的雪旺细胞悬液接种在支架材料上，用MTF法、倒置相差显微镜、流式细胞仪、扫描电镜、RT-PCR、测定雪旺细胞的活性。数据经SPSS软件包处理，结果以均数±标准差表示，采用方差分析。 第三部分：雪旺细胞复合AECM预构建制备人工神经，移植修复大鼠坐骨神经20mm缺损。分为三组：AECM+SC端-端吻合(A组)，AECM+SC端侧吻合(B组)，AECM+SC端侧吻合预构建后再端-端吻合(C组)，各组均修复大鼠坐骨神经20mm缺损，以对侧自体神经倒转移植作为对照组。术后观察肢体情况。进行肌电图、光镜、电镜、图象分析仪及HRP示踪试验检察。 结果： 第一部分：发现组织工程化技术制备的脱细胞细胞外基质虽然细胞被完全消蚀，但还具备原有三维结构及生物活性，经预构建后用其修复SD大鼠15mm坐骨神经缺损时，取得了接近自体神经移植的结果，并且没有缺血或炎性表现，无瘢痕形成。 第二部分：本实验培养出的细胞经S-100特异性抗原免疫荧光法鉴定，证实是纯的雪旺细胞。在AECM上种植SC后，通过倒置相差显微镜、扫描电镜观察到，SC与AECM有良好的黏附特性，在很短的时间内即可见到细胞聚集，培养2周，SC沿着纵行AECM呈螺旋形缠绕在纤维上，可见SC生长、拉丝、分泌ECM。MTT结果提示AECM上三维立体培养的雪旺细胞增殖力较强、数量较多，AECM较适于雪旺细胞的黏附、增殖。通过流式细胞仪发现AECM与雪旺细胞共同培养对细胞周期无影响(如数值)，DNA含量正常，细胞皆为正常二倍体细胞，未见异倍体细胞，无细胞凋亡，表明AECM有良好的细胞相容性；与AECM共同培养的雪旺细胞经RT-PCR扩增出GDNFcDNA片段。 第三部分：术后12、16周：B、C组和自体移植组，神经纤维发育良好，·2·轴突密度、髓鞘厚度、轴突直径无明显差异。A组再生纤维少，结缔组织较多，电生理检测再生神经的潜伏期及波幅低于B、C组(P＜0.05)。B、C组和自体移植组差异无显著意义。髓鞘厚度在术光镜下观察腰骶段脊髓横切片，B组、C组对照组实验侧脊髓腰骶段前角，可见较多的HRP标记的大型运动神经元。统计学处理：全部数据采用SPSS软件包进行统计分析和处理，两组数据间比较采用t检验。 讨论： 第一部分：制备的AECM具备如下特点：抗原性极低，且具备接近在体的网架结构、良好的生物相容性、生物力学性能；FN，LN能较完整保留在细胞外基质内，其表面具备细胞膜受体识别位点，有助于促进与雪旺细胞黏附和神经轴突生长，可作为移植材料修复缺损，从而为AECM修复周围神经长段缺损提供了可行依据。 第二部分：通过MTT、倒置相差显微镜、扫描电镜观察到，SC与AECM有良好的黏附特性，培养2周，SC沿着纵行AECM呈螺旋形缠绕在纤维上，可见SC生长、拉丝、分泌ECM。提示AECM上三维立体培养的雪旺细胞增殖力较强、数量较多，AECM较适于雪旺细胞的黏附、增殖。流式细胞仪发现AECM与雪旺细胞共同培养对细胞周期无影响(如数值)，DNA含量正常，细胞皆为正常二倍体细胞，未见异倍体细胞，无细胞凋亡，表明AECM有良好的细胞相容性；与AECM共同培养的雪旺细胞经RT-PCR扩增出GDNFcDNA片段，说明AECM利于雪旺细胞分泌促进轴突生长的神经营养生长因子。 第三部分：预构建即端侧吻合于坐骨神经干两周，再端-端吻合于缺损处。该法的特点在于：(1)周围神经体内预变性是获得有活性、高质量SCs的一种方便有效的方法，预变性时间以1周结果最佳。可弥补SCs种植量的不足；(2)AECM+SCs是在神经元和末梢效应器存在的自稳态微环境下构建的，因此，形成的人工神经与自体神经更类似，且修复时间不受影响。(3)AECM上的SCs在体内预构建再血管化之前(再血管化的时间为术后5-7天)，SCs存活主要靠神经营养因子的局部扩散。移植后电生理检测，再生神经3个月时其运动诱发电位的潜伏期及波幅A组明显差于B组、C组和自体神经移植组，差异呈显著性，而B组、C组和自体神经移植组无显·3·著性差异。组织学观察发现：B组、C组和自体神经移植组再生神经纤维成束分布，束内有密集、粗大的有髓神经纤维，再生血管散在分布。髓鞘厚度在术后12周时A组亦低于B、C组和对照组，差异有显著意义(P＜0.05)，B组、C组和自体神经移植组无显著性差异。轴突直径及数目两组无差异。光镜下观察腰骶段脊髓横切片，B组、C组和实验组实验侧脊髓腰骶段前角，可见较多的HRP标记的大型运动神经元。 小结：我们认为制备的周围神经AECM材料免疫原性较低，具备完好的神经膜管结构，可起到桥接作用，引导雪旺细胞生长繁殖，其成分对周围神经再生也有促进作用，工艺简便易行，来源容易，是一种较好的神经替代材料，经预构建能够延长其修复缺损的极限距离。 雪旺细胞在AECM上迁移，并表现出在三维立体网架上螺旋式迁移的运动方式。AECM有良好的细胞相容性。因此，可以把雪旺细胞培养在AECM上进行在体移植实验。 采用AECM+SC预构建桥接神经缺损，具有简单易行、需要SC少、是在神经元和末梢效应器存在的自稳态微环境下构建，是一种理想的、可行的神经桥接修复方法。 结论： 1.细胞细胞外基质(AECM)是较理想的自体神经的替代材料。经预构建能够将坐骨神经缺损修复距离由10mm延长到15mm。 2.AECM适于构建具有雪旺细胞活性的组织工程化人工神经。 3.雪旺细胞复合AECM预构建制备人工神经可有效地修复大鼠坐骨神经20mm缺损，为其临床应用奠定实验基础。